Neuroplastin and Plasma Membrane Ca2+ ATPases in murine macrophages : a phenotypical analysis

Abstract

Neuroplastin, an immunoglobulin superfamily transmembrane protein, has been implicated in synaptic plasticity and learning and memory. Moreover, Neuroplastin has been established as a close interacting partner of Plasma Membrane Calcium ATPases (PMCAs). This interaction stabilizes PMCAs, and thus, plays a critical role in maintaining Ca2+ homeostasis within cells. Recent studies have addressed the roles of Neuroplastin-PMCA in immune cells, for which Ca2+ plays a crucial role. While the role of Ca2+ is well-defined in T and B lymphocyte activation, its precise function and the mechanisms of its entry and exit in macrophages remain an active area of research. In this study, I first addressed the relevance of Neuroplastin and PMCA (isoform 1) for Ca2+ homeostasis in macrophages based on knockout mutants. PMCA1 rather than Neuroplastin emerged as vital for regulating intracellular Ca2+ levels. Next, I performed a comparative analysis of signaling, cytokine production, and metabolism in Neuroplastin and PMCA1 knockout macrophages after M1 polarization with IFNg/LPS. Interestingly, despite loss of >70% of PMCAs, Neuroplastin knockout macrophages showed normal canonical signaling (STAT1, NF-kB, ERK1/2) and no or little differences in cytokine production along with moderate elevation of Ca2+ in the ER as well as subdued glycolysis. In contrast, PMCA1 knockout macrophages demonstrated elevated basal and stored Ca2+ levels, upregulated ERK1/2 signaling upon stimulation, and significantly upregulated cytokine production after M1 polarization. Also, these macrophages showed elevated OXPHOS and glycolysis (after M1 polarization). These findings provide an understanding of the role of Neuroplastin and PMCA in macrophage function, shedding light on the underlying fundamental difference between a Neuroplastin and a PMCA knockout macrophage. This study also involved a high-throughput RNAseq analysis of PMCA1 knockout macrophages versus controls before and after stimulation. About 2 to 3% of all genes displayed differential expression in the absence of PMCA1 upon stimulation. Within this fraction, genes related to NF-kB- and Ca2+-signaling, as well as to autoimmune diseases, were found enriched. Together, these findings provide valuable insights into the underlying mechanisms enabling macrophages to survive disturbed Ca2+ homeostasis and maintain polarization within limits. This knowledge could be harnessed to develop strategies for managing conditions associated with disrupted Ca2+ homeostasis, such as degenerative processes and inflammatory diseases.

Neuroplastin, ein Transmembranprotein der Immunglobulin-Superfamilie, ist an der synaptischen Plastizität sowie an Lernen und Gedächtnis beteiligt. Darüber hinaus hat sich Neuroplastin als enger Interaktionspartner von Plasmamembran-Calcium-ATPasen (PMCAs) erwiesen. Diese Interaktion stabilisiert die PMCAs und spielt somit eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der intrazellulären Ca2+-Homöostase. Neuere Studien haben sich mit der Rolle von Neuroplastin-PMCA in Immunzellen befasst, für die Ca2+ eine entscheidende Rolle spielt. Während die Rolle von Ca2+ bei der Aktivierung von T- und B-Lymphozyten gut definiert ist, werden seine genaue Funktion und die Mechanismen seines Eintritts und Austritts in Makrophagen nach wie vor aktiv beforscht. In dieser Studie habe ich zunächst die Bedeutung von Neuroplastin und PMCA (Isoform 1) für die Ca2+-Homöostase in Makrophagen anhand von Knockout-Mutanten untersucht. Es stellte sich heraus, dass PMCA1, jedoch nicht Neuroplastin, für die Regulierung des intrazellulären Ca2+-Spiegels entscheidend ist. Als nächstes führte ich eine vergleichende Analyse der Signalübertragung, der Zytokinproduktion und des Stoffwechsels in Neuroplastin- und PMCA1-Knockout-Makrophagen nach M1- Polarisierung mit IFNg/LPS durch. Interessanterweise zeigten Neuroplastin-Knockout- Makrophagen trotz des Verlusts von mehr als 70 % der PMCAs eine normale kanonische Signalübertragung (STAT1, NF-kB, ERK1/2) und keine oder nur geringe Unterschiede in der Zytokinproduktion sowie eine moderate Erhöhung von Ca2+ im ER und eine gedämpfte Glykolyse. Im Gegensatz dazu zeigten PMCA1-Knockout-Makrophagen sowohl erhöhtes basales Ca2+ als auch deutlich erhöhtes Ca2+ im ER-Speicher und zudem eine hochregulierte ERK1/2-Signalgebung nach Stimulation und eine signifikant erhöhte Zytokinproduktion nach M1-Polarisierung. Darüber hinaus zeigten diese Makrophagen erhöhte OXPHOS als auch Glykolyse (nach M1-Polarisierung). Diese Ergebnisse ermöglichen ein Verständnis der Rolle von Neuroplastin und PMCA bei der Makrophagenfunktion und belegen den grundlegenden Unterschied zwischen Neuroplastin- und PMCA-Knockout-Makrophagen. Die vorliegende Studie enthält auch eine Hochdurchsatz-RNAseq-Analyse von PMCA1-Knockout- Makrophagen im Vergleich zu Kontrollen, vor und nach Stimulation. Etwa 2 bis 3 % aller Gene zeigten eine unterschiedliche Expression in Abwesenheit von PMCA1 nach Stimulation. Innerhalb dieser Fraktion sind Gene angereichert, die mit NF-kB - und Ca2+-Signalen sowie mit Autoimmunkrankheiten in Verbindung stehen. Zusammengenommen bieten diese Ergebnisse wertvolle Einblicke in die zugrundeliegenden Mechanismen, die es Makrophagen ermöglichen, eine gestörte Ca2+-Homöostase zu überleben und ihre Polarisierung in Grenzen zu halten. Dieses Wissen könnte genutzt werden, um Strategien zur Behandlung von Zuständen zu entwickeln, die mit einer gestörten Ca2+-Homöostase einhergehen, wie z.B. degenerative Prozesse und Entzündungskrankheiten.