The substrate specificity of N-end rule components from Arabidopsis thaliana

Abstract

Proteinabbau in Abhängigkeit des N-Terminus dient als Auslöser von pflanzlichen Signalwegen. In Arabidopsis wird dies vermittelt durch die beiden E3 Ubiquitinligasen PRT1 und PRT6. In der vorliegenden Arbeit wurde eine biochemische Charakterisierung dieser Komponenten sowie von der Arginin-Transferase ATE1 vorgenommen, die eine Untersuchung der direkten Interaktionen mit künstlichen Peptiden beinhaltet. Dabei trat zu Tage, dass PRT1 an Sequenzen bindet, die den proteolytischen N-Termini des Ethylen-Signalmoleküls EIN2 und der E3-Ligase BB nachempfunden waren. Damit in Übereinstimmung konnte gezeigt werden, dass das EIN2-Fragment in Protoplasten in Abhängigkeit von PRT1 und von seinem N-Terminus instabil ist. Kein morphologischer Phänotyp wurde gefunden, der auf PRT1-Funktion zurückzuführen wäre; jedoch wurden bei der prt1-1-Linie konditionale männliche Sterilität sowie Cytokinin-Hyposensitivität festgestellt, die auf dem genetischen Hintergrund beruhten. Diese Arbeit bietet neue Einblicke in die Substratauswahl durch pflanzliche N-Recognine und ATE1 und deutet auf eine Funktion von PRT1 in der Regulation von EIN2 und BB hin.

N-terminus dependent protein degradation has emerged to initiate signaling pathways in plants. In Arabidopsis, this is mediated by at least two E3 ubiquitin ligases: PROTEOLYSIS 1 and PRT6. Here, I provide a biochemical characterization of components of the plant N-degron pathways comprising direct interactions with artificial peptides performed by PRT1, PRT6, and ARGININE-TRNA PROTEIN TRANSFERASE 1 (ATE1). Strikingly, peptide-library screening revealed strong PRT1-binding to peptide sequences mimicking the protease-generated N-termini of ETHYLENE INSENSITIVE 2 (EIN2) and BIG BROTHER (BB). Pertinently, PRT1- and N-terminus dependent destabilization of the EIN2 C-terminal fragment was demonstrated in protoplasts. No morphological phenotype could be attributed to the loss of PRT1 function; however second-site genomic alterations conferring temperature-dependent male sterility and cytokinin-hyposensitivity were detected in the prt1-1 line. Together, this work provides new insights into the substrate selection performed by plant N-recognins and ATE1, and hints at a function of PRT1 in regulating EIN2 and BB protein stability.