Hypervirulent Clostridioides difficile induces a multifaceted response in human mucosal-associated invariant T cells

Abstract

Clostridioides difficile infections (CDI) are the major cause of antibiotics-associated colitis with increasing prevalence in morbidity and mortality. Pathogenesis of C. difficileassociated colitis (CDAC) is linked to secreted C. difficile toxins. Severe CDAC is mostly caused by so-called hypervirulent C. difficile strains that are capable to produce the three C. difficile toxins TcdA, TcdB, and binary CDT. CDI is an age-associated infection and aged individuals show a substantial increase in CDI incidence. The recently identified mucosal-associated invariant T (MAIT) cells represent an abundant innate-like T cell population in the intestinal mucosa exhibiting anti-bacterial functions. MAIT cells are able to sense metabolites derived from bacterial riboflavin biosynthesis that are presented by the major histocompatibility complex class I-related protein MR1. C. difficile is considered to produce riboflavin, but the role of MAIT cells in CDI is largely unknown. The first part of this thesis addressed the question whether MAIT cells from elderly individuals exhibit functional adaptions potentially contributing to their increased CDI susceptibility. A comparative quantitative proteome approach was used to analyze primary human MAIT cells in healthy young and aged individuals. MAIT cell proteomes of aged individuals did not indicate a global phenotypic switch. However, increased abundances of a few proteins in aged individuals could be detected including STING and BCL2 suggesting that with increasing age MAIT cells might exhibit reduced proliferative capacity. Moreover, donor variations for e.g. HLA components were found significantly higher in aged individuals, which together with reduced proliferative capacity might contribute to increased CDI susceptibility. In the second part, it was investigated whether C. difficile activates human MAIT cells and whether this activation would occur MR1-dependent or -independent. Stimulation with toxin-free C. difficile in vitro indeed resulted in robust activation of primary human MAIT cells, which could be validated to depend on MR1 and partly on the cytokines IL- 12 and IL-18. Activated MAIT cells were found to produce IFN that is known to play a protective role in CDI. However, C. difficile stimulated MAIT cell cytotoxicity, which is considered as anti-bacterial but might as well contribute to loss of barrier functions in CDI. Interestingly, cytotoxic MAIT cell response was found even more pronounced following stimulation with hypervirulent C. difficile strains. In summary, C. difficile provokes strong activation of primary human MAIT cells, which might directly contribute to the immunopathology in CDI. The third part of this thesis focused on the specific contribution of C. difficile toxins TcdA, TcdB and binary CDT to the activation of human MAIT cells. All toxins are known to interfere with host GTPase signaling or actin polymerization following their internalization by different host receptors and were not studied in the context of MAIT cells before. Strikingly, this thesis revealed that TcdA and CDT, but not TcdB selectively activated the MAIT cell subset in peripheral blood mononuclear cell culture, whereby TcdA induced superior cytotoxicity compared to CDT, and additionally significant IFN

response. Furthermore, TcdA/ CDT stimulation was found to synergize with the MR1- dependent activation pathway. Eventually, toxin-mediated responses were demonstrated to be MR1-dependent even in the absence of bacterial metabolites. This MR1-dependency revealed a new and so far uncharacterized toxin-specific mechanism to trigger MAIT cell activation and suggests MR1 as a key regulator to modulate MAIT responses in CDI. Simultaneous stimulation with C. difficile, TcdA, and CDT in particular enhanced the proinflammatory IFN response of MAIT cells. Because IFN is known to play a protective role in CDI, increased IFN response might reflect a predominantly protective potential of MAIT cells in infections with hypervirulent C. difficile strains. In summary, in-depth characterization of C. difficile-induced MAIT cell response suggests a multifaceted role of MAIT cells that might be protective but as well detrimental in terms of immunopathology in CDI.

Clostridioides difficile Infektionen (CDI) stellen die Hauptursache für Antibiotika-assoziierte Kolitis dar, die eine zunehmende Prävalenz an Morbidität und Mortalität aufweist. Die Pathogenese von C. difficile-assoziierter Kolitis (CDAK) wird mit den sekretierten C. difficile-Toxinen assoziiert. Schwere CDAK wird meist durch sogenannte hypervirulente C. difficile-Stämme verursacht, die in der Lage sind, drei C. difficile-Toxine zu produzieren: TcdA, TcdB und binäres CDT. CDI selbst ist eine altersassoziierte Infektion und ältere Menschen zeigen eine erhöhte Anfälligkeit für CDI. Die kürzlich identifizierten Mukosalassoziierten invarianten T-(MAIT-)Zellen repräsentieren eine abundante T-Zellpopulation in der Darmschleimhaut, die Merkmale der angeborenen Immunität aufweist und antibakterielle Funktionen ausführen kann. MAIT-Zellen sind in der Lage, Metaboliten aus der bakteriellen Riboflavin-Biosynthese zu erkennen, die über das Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I-verwandte Protein MR1 präsentiert werden. C. difficile wird als aktiver Riboflavinproduzent betrachtet, jedoch ist die Rolle von MAIT-Zellen in CDI weitestgehend unbekannt. Der erste Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Frage, ob MAIT-Zellen von älteren Menschen funktionelle Anpassungen aufweisen, die möglicherweise zu ihrer erhöhten Anfälligkeit für CDI beitragen. Ein quantitativer Proteomansatz wurde verwendet, um primäre humane MAIT-Zellen von jungen und alten gesunden Spendern zu vergleichen. Dabei zeigten die MAIT-Zellproteome von ältere Spendern keine globalen phänotypischen Veränderungen. Allerdings konnte eine erhöhte Expression von einigen wenigen Proteinen, inklusive STING und BCL2, bei älteren Spendern nachgewiesen werden. Diese geben einen Hinweis darauf, dass MAIT-Zellen mit zunehmendem Alter eine verringerte Proliferationskapazität aufweisen könnten. Darüber hinaus wurden spenderabhängig signifikant höhere Expressionsstreuungen für z. Bsp. HLA-Komponenten bei älteren Spendern gefunden, was zusammen mit einer verminderten Proliferationskapazität zu einer erhöhten Anfälligkeit für CDI führen könnte. Im zweiten Teil wurde untersucht, ob C. difficile in der Lage ist humane MAIT-Zellen zu aktivieren und ob diese Aktivierung MR1-abhängig oder -unabhängig erfolgen würde. In vitro Stimulation mit C. difficile, unter Ausschluss der Toxineffekte, führte zu einer robusten Aktivierung der primären humanen MAIT-Zellen, die nachweislich sowohl von MR1 als auch teilweise von den Zytokinen IL-12 und IL-18 abhängig war. Aktivierte MAIT-Zellen produzierten dabei IFN , dem eine protektive Funktion in der CDI zugewiesen wird. C. difficile induzierte jedoch auch die Zytotoxizität in MAIT-Zellen, die als antibakteriell angesehen wird, genauso gut aber auch zum Verlust von Barrierefunktionen in CDI beitragen kann. Interessanterweise war die zytotoxische MAIT-Zellantwort noch ausgeprägter nach der Stimulation mit hypervirulenten C. difficile-Stämmen. Zusammenfassend ist zu sagen, dass C. difficile eine starke Aktivierung von primären menschlichen MAIT-Zellen induziert, die direkt zur Immunopathologie bei CDI beitragen könnte. Der dritte Teil dieser Arbeit befasste sich mit dem Einfluss der C. difficile-Toxine TcdA, TcdB und binäres CDT auf die Aktivierung humaner MAIT-Zellen. Es ist bekannt, dass die Toxine nach ihrer Internalisierung durch verschiedene Wirtsrezeptoren die GTPase- Signalübertragung bzw. die Aktin-Polymerisation des Wirts stören und bisher nicht im Zusammenhang mit MAIT-Zellen untersucht wurden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass TcdA und CDT, jedoch nicht TcdB, die MAIT-Zellpopulation innerhalb der mononukleären Zellen des peripheren Blutes selektiv aktivieren. Hierbei induzierte TcdA im Vergleich zu CDT eine höhere Zytotoxizität und zusätzlich eine signifikante IFN -Antwort. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die TcdA/ CDT-Stimulation synergistisch mit dem MR1-abhängigen Aktivierungsweg zusammenwirkt. Schließlich wurde gezeigt, dass die toxinvermittelten MAIT-Zellantworten auch in Abwesenheit von bakteriellen Metaboliten MR1-abhängig waren. Diese MR1-Abhängigkeit deckt einen neuen und bislang nicht charakterisierten toxinspezifischen Mechanismus zur MAIT-Zellaktivierung auf und legt MR1 als ausschlaggebenden Regulator zur Beeinflussung der MAITZellantwort bei CDI nahe. Insbesondere die kombinierte Stimulation mit C. difficile, TcdA und CDT verstärkte die proinflammatorische IFN -Antwort der MAIT-Zellen. Da bekannt ist, dass IFN eine protektive Rolle bei CDI spielt, könnte eine erhöhte IFN - Antwort eine vorwiegend protektive Funktion der MAIT-Zellen bei Infektionen mit hypervirulentem C. difficile Stämme widerspiegeln. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die detaillierte Charakterisierung der C. difficile-induzierten MAIT-Zellantwort auf eine vielfältige Rolle von MAIT-Zellen hindeutet, die zwar protektiv, aber hinsichtlich der Immunopathologie bei CDI auch schädlich sein könnte.