Mental retardation-related protease neurotrypsin in spinogenesis, synaptic plasticity and learning

Abstract

Several studies implicate the role of extracellular proteases in synaptic plasticity, learning, and memory (Gundelfinger et al., 2010; Tsilibary et al., 2014). Neurotrypsin (NT), a neuronal trypsin-like serine protease, has been recognized to play an essential role in cognitive brain function because a 4-nucleotide deletion, which results in an earlier stop codon, is associated with severe mental retardation in humans (Molinari et al., 2002). Moreover, it has been recently shown that Cln1-/- mice, a mouse model of a neurodegenerative lysosomal storage disease, in which NT activity is suppressed due to upregulation of its inhibitor serpina1, have substantially reduced agrin-22 levels (the specific product of neurotrypsin-dependent cleavage of agrin) and this may be related with the synaptic dysfunction present in the disease (Peng et al., 2015). In the adult central nervous system (CNS), NT mRNA is highly expressed in the hippocampus, the cerebral cortex and the amygdala (Gschwend et al., 1997). In the developing mouse brain, postnatal NT mRNA is strongly expressed in cortex and hippocampus, reaching its peak of expression during neural development and correlating with periods of synaptogenesis (Wolfer et al., 2001). By electron microscopy, NT was localized at the presynaptic terminals of human cortical synapses (Molinari et al., 2002). Live imaging studies on cultured hippocampal neurons revealed that neurotrypsin is recruited and released from synapses in an activity-dependent manner (Frischknecht et al., 2008). Interestingly, proteolytic activity of NT requires synchronous activation of NMDA receptors (Matsumoto-Miyai et al., 2009). This illustrates that NT is released from the presynaptic terminals in its inactive form and it is activated in the extracellular space by a postsynaptic NMDAR-dependent mechanism. The unique known substrate for NT is the extracellular matrix (ECM) molecule agrin (Reif et al., 2007). Particularly, synaptic agrin is cleaved by NT at two sites  and , yielding a 110 kDa N-terminal fragment, a 90 kDa internal fragment, and a 22 kDa C-terminal fragment (Stephan et al., 2008). In NT knockout mice, no proteolytic fragments of agrin can be detected, suggesting agrin to be exclusively processed by NT in the CNS (Reif et al., 2007). Activity-dependent exocytosis of NT from presynaptic terminals and cleavage of agrin induces the formation of dendritic filopodia in the context of NMDA receptor-dependent plasticity. This is supported by the finding that in NT-deficient mice no activity-dependent generation of dendritic filopodia could be observed. However, activity-dependent formation of filopodia could be rescued in the NT-deficient mice by application of agrin-22 but not agrin-90 (Matsumoto-Miyai et al., 2009). Agrin-22 induces dendritic filopodia through its binding and inhibiting the neuronal alpha3 Na+/K+ ATPase (alpha3NKA) (Hilgenberg et al., 2006a). Taken together, these results qualify neurotrypsin-dependent agrin cleavage as a coincidence detector for correlated activity of the presynaptic and postsynaptic neuron, with a possible involvement in synapse formation and thus, Hebbian learning. In this thesis, we investigated the putative involvement of neurotrypsin in functional synaptic plasticity, different types and phases of learning, social behaviour, and spinogenesis and spine morphology in naïve conditions and upon learning. The results revealed impairments of specific forms of long-term potentiation, behaviour and striking differences in spines in NT-deficient mice compared to their WT littermates. Moreover, we could rescue the spine loss in NT knockout mice by injecting an adeno-associated virus (AAV) expressing agrin-22 and thus form a basis for a search of mechanistic treatments that would restore plasticity and behaviour in these mutants.

Verschiedene Studien implizieren die Rolle von extrazellulären Proteasen in der synaptischen Plastizität, im synaptischen Lernen sowie der synaptischen Erinnerung (Gundelfinger et al., 2010; Tsilibary et al., 2014). Der neuronalen, Trypsin-ähnlichen Serinprotease Neurotrypsin (NT) wird eine wichtige Rolle in der kognitiven Gehirnfunktion zugeschrieben, weil eine 4-Nukleotid-Mutation, welche ein früheres Stopcodon zur Folge hat, mit schwerwiegenden geistigen Behinderungen bei Menschen in Verbindung gebracht wird (Molinari et al., 2002). Zudem wurde kürzlich veröffentlicht, dass CIn1-/--Mäuse, ein Maus-Modell neurodegenerativer, lysosomaler Speicherkrankheiten, in denen die Neurotrypsin-Aktivität durch die Hochregulierung des Hemmstoffs Serpina1 unterdrückt wurde, eine stark reduzierte Konzentration von Agrin-22 (das Produkt von Neurotrypsin-abhängiger Zellteilung von Agrin) zeigen. Dies kann mit der synaptischen Funktionsstörung der Krankheit zusammenhängen (Peng et al., 2015). Im zentralen Nervensystem von Erwachsenen (ZNS) wird NT-mRNA hauptsächlich im Hippokampus, der Großhirnrinde und der Amygdala ausgeschüttet (Gschwend et al., 1997). Im sich entwickelnden Gehirn einer Maus wird NT-mRNA verstärkt in der Großhirnrinde und im Hippokampus exprimiert, wobei die NT-mRNA-Expression während der neuralen Entwicklung am höchsten ist. Außerdem korreliert die NT-mRNA-Expression mit den Phasen der Synaptogenese (Wolfer et al., 2001). Mit Hilfe von Elektronenmikroskopie wurde NT an den presynaptischen Enden von menschlichen, kortikalen Synapsen lokalisiert (Molinari et al., 2002). Live-Imaging-Studien an kultivierten Hippokampus-Neuronen zeigten dabei, dass NT von den Synapsen in einer aktivitätsabhängigen Art und Weise erneuert und ausgeschüttet wird (Frischknecht et al., 2008). Die proteolytische Aktivität von NT erfordert interessanterweise die synchrone Aktivierung von NMDA-Rezeptoren (Matsumoto-Miyai et al., 2009). Demnach wird NT von den presynaptischen Enden in seiner inaktiven Form abgegeben und erst im extrazellulären Raum von einem postsynaptischen, NMDAR-abhängigen Mechanismus aktiviert. Das einzig bekannte Substrat für NT ist Agrin, ein Molekül der extrazellulären Matrix (ECM) (Reif et al., 2007). Synaptisches Agrin wird von NT an den zwei Seiten a und b geteilt, woraus ein N-terminales Fragment (110 kDa), ein internes Fragment (90 kDa) und ein C-terminales Fragment (22 kDa) entstehen (Stephan et al., 2008). In NT-Knockout-Mäusen können keine proteolytischen Fragmente von Agrin nachgewiesen werden, was eine exklusive Verarbeitung Agrins von NT im ZNS vermuten lässt (Reif et al., 2007). Aktivitätsabhängige Exozytose von NT in presynaptischen Nervenenden und die Teilung von Agrin führen zur Entstehung dendritischer Filopodien im Kontext der NMDA-Rezeptor-abhängigen Plastizität. Gestützt wird dies durch den Befund, dass in NT-Knockout-Mäusen keine aktivitätsabhängige Bildung von dendritischen Filopodien beobachtet werden konnte. Die aktivitätsabhängige Bildung von Filopodien konnte bei diesen Mäusen jedoch durch die Verwendung von Agrin-22 wiederhergestellt werden, wohingegen Agrin-90 keine Wirkung erzielte (Matsumoto-Miyai et al., 2009). Agrin-22 erzeugt dendritische Filopodien durch seine Bindung und Hemmung von neuronaler alpha3-Na+/K+-ATPase (a3NKA) (Hilgenberg et al., 2006a). Zusammenfassend qualifizieren diese Ergebnisse Neurotrypsin-abhängige Agrin-Zellteilung als einen Koinzidenzdetektor für die korrelierende Aktivität des presynaptischen und des postsynaptischen Neurons mit einer möglichen Mitwirkung bei der Synapsen-Entstehung und somit des Hebbschen Lernens. In dieser Doktorarbeit untersuchten wir die vermeintliche Mitwirkung von Neurotrypsin in der funktionalen, synaptischen Plastizität, den verschiedenen Typen und Phasen des Lernens, dem sozialen Verhalten sowie der Genese und der Morphologie von Dornfortsätzen sowohl unter naiven Bedingungen als auch im Lernprozess. Die Ergebnisse zeigten Beeinträchtigungen von speziellen Formen der Langzeitpotenzierung, des Verhaltens sowie starke Unterschiede der Dornfortsätze bei Mäusen mit einem NT-Defizit verglichen mit ihren WT-Wurfgeschwistern. Darüber hinaus konnten wir den Dornfortsatz-Verlust bei NT-Knockout-Mäusen mittels Injektionen von Adeno-assoziierten Viren (AAV), welche Agrin-22 ausschütten, retten und somit eine Grundlage für die Suche nach mechanistischen Verfahren für die Wiederherstellung der Plastizität und des Verhaltens in diesen Mutationen legen.