Die Flexibilität von TAL-Effektoren in der Natur und als molekulare Werkzeuge zur Genaktivierung und Genommodifikation

Abstract

TALEs sind Proteine phytopathogener Xanthomonas, die in Pflanzenzellen an DNAZielsequenzen binden und so Transkription aktivieren. Ihre DNA-Bindedomäne besteht aus 33-35 Aminosäuren (As) langen Sequenzwiederholungen (repeats), von denen jede ein Nukleotid der Zielsequenz spezifisch erkennt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass TALEs mit einem aberranten repeat von 30, 39, 40 oder 42 As sowohl die optimale als auch eine um -1 Nukleotid verschobene Zielsequenz erkennen. Dies wurde für Aktivatoren genutzt, die verschiedene Promotorvarianten flexibel induzieren konnten. Weiterhin wurde gezeigt, dass artifizielle TALEs durch kooperatives Zusammenwirken mit endogenen Transkriptionsfaktoren effizient aktivieren. Außerdem wurden als Alternative zu paarigen TALE-Nukleasen (TALEN) einkettige Varianten erstellt, die effizient DNA schnitten, jedoch nicht zu Mutationen in Zellen führten. Darüber hinaus wurden hochspezifische TALEN erstellt, die zwei Sequenzen anhand nur einer Base unterscheiden.

TALEs are proteins of phytopathogenic Xanthomonas species. They bind to promoter sequences in the host plant cells and thereby induce genes. Their DNA-binding domain consists of 33 to 35 amino acid (aa) tandem repeats. Each repeat specifically recognizes one nucleotide in the target sequence. In this work, it was demonstrated that TALEs with an aberrant repeat of 30, 39, 40 or 42 aa recognize an optimal target sequence as well as one with a -1-nucleotide frameshift. This was used to generate TALEs that efficiently induced transcription at several promoter variants. Furthermore, it was shown that artificial TALEs are able to cooperatively induce transcription together with endogenous transcription factors. Additionally, single chain TALE nucleases (scTALEN) were constructed as an alternative to TALEN pairs. Although efficiently cleaving DNA in vitro, these scTALEN did not induce mutations in living cells. Finally, TALEN-pairs with a single nucleotide specificity were generated.