Involvement of TRPC4 and TRPC5 channels in persistent firing in the hippocampus and in the medial entorhinal cortex

Abstract

Persistent neural activity is a repetitive neural spiking that persists beyond the triggering stimulus and it can last from tens of seconds to even several minutes. This neural activity has been observed in vivo during working memory and temporal association tasks and, it has been proposed to support short-term retention of information (up to tens of seconds). Many studies investigated persistent firing (PF) and synaptic and intrinsic cellular mechanisms have been proposed to support it. However, the cellular mechanisms underlying PF are not yet fully understood. Previous studies reported that in brain areas involved in working memory, such as hippocampus and entorhinal cortex, individual neurons showed PF through an intrinsic cellular mechanism supported by transient receptor potential canonical (TRPC) channels. Recent behavioural studies demonstrating the involvement of TRPC channels in working memory, made the hypothesis that TRPC-driven persistent firing supports working memory a very attractive one. However, recent findings, showing that that in TRPC knock out (KO) mice PF is unchanged, put in discussion this hypothesis. To further assess the involvement of TRPC channels in PF, in my experiments these channels were targeted with different methods aiming to inhibit their activity. Given the expression levels in the medial temporal lobe (MTL), TRPC4 and TRPC5 were chosen as main candidate to support persistent firing. In this dissertation work I focused on two areas of the MTL reported to have a role in temporal association and in working memory tasks: the hippocampal CA1 and the layer II of the medial entorhinal cortex (MEC). Novel and highly specific TRPC channel blockers (ML204, clemizole hydrochloride, Pico145) were tested for the first time in CA1 pyramidal cells: when TRPC4 and\or TRPC5 were inhibited, also PF was reduced or suppressed. The intracellular application of anti-TRPC4 or anti-TRPC5 antibodies also inhibited PF, confirming the results obtained with the novel blockers. Taken together these results indicate that TRPC4 and TRPC5 channels support PF in CA1 pyramidal neurons. Given the recent controversies raised by studies using KO models, I also tested PF in TRPC4 KO and in TRPC5 conditional KO models. In line with previous studies, I observed PF in TRPC4 KO mice. The TRPC5 conditional KO model was chosen to avoid compensatory mechanisms and up to now this is the first time this model has been used to study persistent firing in the CA1 pyramidal neurons. Quantitative PCRs made on TRPC5 conditional KO mice, showed that the conditional KO happened, however four weeks after infection compensatory mechanisms were already affecting the expression of TRPC3 and TRPC4. Unexpectedly the adenoviral vector used to induce the TRPC5 conditional KO, had unwanted and unspecific side effects affecting the plateau potential during cholinergic stimulation. For this reason, these results were not conclusive. Nevertheless, these results highlighted the crucial importance of planning proper controls when using KO models, often missing even in published studies, and showed that compensatory mechanism can affect also conditional KO models. In the second project, I focused on the MEC layer II. In this area, immunohistochemical stainings revealed that while TRPC4 were predominantly expressed in clusters of calbindin positive cells, TRPC5 were predominantly expressed out of these TRPC4-calbinind clusters. Given the structural and activation similarities between these two channels, this expression pattern was unexpected but interesting, as a recent model proposed that island (calbindin positive) and ocean (calbindin negative) cells differentially contribute to the memory formation in temporal association, by affecting the processing in CA1. In the MEC layer II, the application of clemizole hydrochloride inhibited PF only when used at higher concentration, but not at lower concentration, when targeting only TRPC5. Although these preliminary data need to be deepened, they suggest that TRPC channels, excluding TRPC5, are involved in the cellular mechanisms supporting working memory. Taken together, these data indicate that TRPC channels have a central role in supporting persistent in CA1 pyramidal cells and in MEC layer II neurons.

Unter anhaltender neuronaler Aktivität versteht man sich wiederholendes, neuronales Feuern, das über den auslösenden Reiz hinaus und Dutzende von Sekunden bis zu mehreren Minuten andauern kann. Diese neuronale Tätigkeit wurde anhand von in vivo während der Vorgänge im Arbeitsgedächtnis und bei zeitlichen Zuordnungen beobachtet. Es wird ebenfalls angenommen, dass sie die kurzfristige Speicherung von Informationen (bis zu mehreren Sekunden) unterstützt. Obwohl viele Studien das anhaltende Feuern untersucht haben – auch wenn bislang angenommen wurde, das synaptische und intrinsische Zellmechanismen es bedingen würden -, fehlt weiterhin das Verständnis der zugrunde liegenden zellulären Mechanismen. In früheren Studien wurde berichtet, dass in Bereichen wie dem Hippocampus und dem entorhinalen Kortex, die mit dem Arbeitsgedächtnis zusammenhängenden, das anhaltende Zünden in einzelnen Neuronen anhand eines spezifischen Zellmechanismus nachweisbar war, der mit den kanonischen Kanälen des transienten Rezeptorpotenzials (engl. transient receptor potential canonical = TRPC) verbunden ist. Neuere Verhaltensstudien, welche die Beteiligung von TRPC-Kanälen am Arbeitsgedächtnis belegen, erbrachten die durchaus ansprechende Hypothese, dass TRPC-gesteuertes anhaltendes Zünden das Arbeitsgedächtnis unterstützt. Jüngste Erkenntnisse, die ein unverändertes anhaltendes Feuern bei TRPC-Knockout-Mäusen zeigen, haben diese Hypothese jedoch zur Diskussion gebracht. In meinen Experimenten zur weiteren Untersuchung der Beteiligung von TRPC-Kanälen am anhaltenden Feuern wurden diese Kanäle mit verschiedenen Methoden gezielt angegriffen, um ihre Aktivität zu hemmen. In Anbetracht der Ausprägungsebenen im mittleren Schläfenlappen wurden TRPC4 und TRPC5 als Hauptverantwortliche bei der Beteilung am anhaltenden Zünden bestimmt. In dieser Dissertation habe ich mich auf zwei Bereiche des mittleren Schläfenlappen konzentriert, denen eine Rolle bei der zeitlichen Zuordnung und den Aufgaben des Arbeitsgedächtnisses zugeschrieben wird: die CA1-Pyramidenzellen und die Schicht II-Neuronen des medialen entorhinalen Kortex (MEC). Neuartige und hochspezifische Blocker des TRPC-Kanals (ML204, Clemizol Hydrochlorid, Pico145) wurden erstmalig in der CA1-Pyramidenschicht getestet: Wenn TRPC4 und\oder TRPC5 gehemmt wurden, wurde auch das anhaltende Zünden verringert oder unterdrückt. Die intrazelluläre Verwendung von TRPC4- oder TRPC5- Antikörpern hemmte das anhaltende Feuern ebenfalls und bestätigte damit die mit den neuartigen Blockern erzielten Ergebnisse. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass TRPC4- und TRPC5-Kanäle das fortwährende Zünden in CA1-Pyramidenneuronen unterstützen. Angesichts der jüngsten Kontroversen, die durch Studien mit Knockout-Modellen ausgelöst wurden, habe ich das anhaltende Zünden auch in TRPC4- und zum ersten Mal in einem bedingten TRPC5-Knockout-Modell getestet. In Übereinstimmung mit früheren Studien beobachtete ich das fortwährende Zünden bei TRPC4-Knockout-Mäusen; dennoch deuten meine Daten darauf hin, dass Kompensationsmechanismen den Mangel an TRPC4 ausgleichen könnten. Das konditionale TRPC5-Knockout-Modell wurde gewählt, um Kompensationsmechanismen zu vermeiden. Bisher wurde dieses Modell erstmalig zur Untersuchung des fortwährenden Zündens in den CA1-Pyramidenneuronen verwendet. Anhand der qPCR-Methode, die an TRPC5 konditionierten Knockout-Mäusen durchgeführt wurde, zeigte sich, dass der konditionierte Knockout auftrat, jedoch vier Wochen nach der Infektion bereits Kompensationsmechanismen vorhanden waren, die die Expression von TRPC3 und TRPC4 beeinflussten. Überraschenderweise hatte der adenovirale Vektor, der zur Induktion des TRPC5-Knockouts verwendet wurde, unerwünschte und unspezifische Nebenwirkungen, die das Membranpotential der getesteten Zellen stark depolarisierten. Aufgrund dessen waren die Ergebnisse nicht schlüssig. Trotz allem haben sie die entscheidende Bedeutung geeigneter Kontrollen bei der Verwendung transgener Modelle deutlich gemacht, die selbst in veröffentlichten Studien oft fehlen. Sie haben gezeigt, dass Kompensationsmechanismen auch in konditionalen Knockout-Modellen vorhanden sind. Im zweiten Projekt konzentrierte ich mich auf die Schicht II-Neuronen des medialen entorhinalen Kortex‘. In diesem Bereich zeigten immunhistochemische Färbungen, dass TRPC4 vorwiegend in Gruppen von Calbindin-positiven Zellen, während TRPC5 vorwiegend aus diesen TRPC4-Calbindin-Gruppen in Erscheinung getreten ist. Angesichts der strukturellen und aktivierungsbedingten Ähnlichkeiten zwischen den beiden Kanälen war dieses Muster unerwartet, jedoch interessant, denn: Ein neueres Modell wirft die Theorie auf, dass Insel- (Calbindin-positiv) und Ozeanzellen (Calbindin-negativ) unterschiedlich zur Gedächtnisbildung bei der zeitlichen Zuordnung beitragen, indem sie die Verarbeitung in CA1-Pyramidenzellen beeinflussen. In den Schicht II-Neuronen des medialen entorhinalen Kortex hemmte die Anwendung von Clemizol Hydrochlorid das andauernde Zünden nur dann, wenn es in höherer Konzentration verwendet wurde, jedoch nicht in niedrigerer Konzentration, wenn sie nur auf TRPC5 abzielte. Obwohl diese vorläufigen Daten vertieft werden müssen, suggerieren sie, dass die TRPC-Kanäle an den zellulären Mechanismen, die das Arbeitsgedächtnis unterstützen, beteiligt sind. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass TRPC-Kanäle bei der Unterstützung des anhaltenden Zündens in CA1-Pyramidenzellen und in MEC-Schicht-II-Neuronen eine Rolle spielen.