Nanoparticles delivery to the central nervous system in-vivo : PVP nanoparticles for brain drug delivery and neuroprotection with siRNA-caspase-3

Abstract

Neurological disorders are on the rise and they represent the second largest category of life-threatening diseases. Although significant achievements have been attained in the brain anatomy and pathology, many potential drug treatments aimed at the central nervous system (CNS)’ diseases are limited in their ability to improve clinical outcomes. This is due to the blood-neural barriers, such as the blood-brain barrier (BBB), which separates the vascular system from the CNS parenchyma. But functionalized nanoparticles have successfully overcome these barriers, offering new strategies for brain drug delivery when loaded with diagnostic or therapeutic agents. However, none has achieved the market approval to date. At the same time, neuronal cell death (apoptosis) after a CNS trauma is problematic, because post-apoptosis induces irreversible neuronal damage. Hence, an important objective is to prevent or stop the apoptosis process to protect the lesioned neurons from dying. In the same context, siRNA-based gene therapy holds a great promise to induce neuroprotection by targeting the genes responsible for the execution of the apoptosis process. Yet, siRNA-based therapies are mainly devoted for the treatment of liver diseases and few authors studied it for neuroprotection in-vivo. In this study I investigated two polymeric nano-carriers platform to target the CNS. The first was to study functionalized polyvinylpyrrolidone nanoparticles (PVP-NPs) to cross the blood-retina barrier (BRB)- which can reflect the situation at the BBB- using a rat model of in-vivo imaging of the retina. The second was to study the poly (butyl-cyanoacrylate) nanoparticles (PBCA NPs) as nano-carriers for caspase-3-siRNA for delivery to the retina and investigate its ability in-vivo to stop the apoptosis of retinal ganglion cells after damage using in-vivo imaging to the retina. PVP NPs were loaded with hydrophobic fluorescent markers (Dil and FITC) as a surrogate for hydrophobic drugs and injected intravenously into the tail vein of rats. PVP-Dil-CFSE NPs had a particle size of 344 nm, a polydispersity index (PDI) of 0.26 and a negative zeta potential of -15 mv. My results indicate that linking the hydrophobic fluorescence marker (Carboxyfluorescein-succinimidyl-ester) CFSE to the surface of the PVP NPs can induce their passage into the retina tissue. In addition, I observed a substantial internalization of the modified NPs into blood cells which was revealed by the ex-vivo wholemount retina imaging. On the other hand, caspase-3 siRNA encapsulated in PBCA NPs (CaspNPs) was produced with a particle size of 143 nm, a polydispersity index (PDI) of 0.26 and a negative zeta potential of -9.87 mv. Specification of blank PBCA NPs was 124.08 nm, 0.26 PDI and -11.96 mv. To test the effects in-vivo, a rat optic nerve crush (ONC) model was employed in this study. Lesioned cells were treated with CaspNPs and blank PBCA NPs which were delivered into the eye by intravitreal injection. Longitudinal, repeated retinal ganglion cell counts using confocal neuroimaging showed that post-traumatic cell loss after CaspNPs injection was only 36.1% versus 63.4% in controls. In sum, the results of the first study indicate PVP NPs to be a potential new nano-carrier platform to target the brain while hidden in the blood cells. The second study results suggest that CaspNPs can serve as a potential therapeutic tool to reduce/stop neurons cell death, which may be valuable for neuroprotection or neuromodulation of central nervous system dysfunction in neurological disorders. Though my in-vivo experiments with rats show promising results that NPs can deliver drugs and genes to the CNS, more pre-clinical and clinical studies are needed to verify these conclusions.

Neurologische Erkrankungen nehmen zu und stellen die zweitgrößte Kategorie der lebensbedrohlichen Krankheiten dar. Obwohl auf dem Gebiet der Anatomie und Pathologie des Gehirns bedeutende Entwicklungsfortschritte erzielt wurden, sind viele potenzielle medikamentöse Behandlungen von Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) in ihrer Eignung begrenzt, die klinischen Ergebnisse zu verbessern. Dies ist auf Blut-neurale Barrieren zurückzuführen, wie z.B. die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die das Gefäßsystem vom ZNS-Parenchym trennt. Funktionalisierte Nanopartikel haben diese Barrieren jedoch erfolgreich überwunden und bieten neue Strategien für die Verabreichung von Medikamenten in das Gehirn, wenn sie mit Diagnostika/Therapeutika beladen sind. Bislang hat jedoch noch kein Arzneimittel mit Nanopartikeln die Marktzulassung erreicht. Außerdem ist der neuronale Zelltod (Apoptose) nach einem ZNS-Trauma problematisch, da die Post-Apoptose irreversible, neuronale Schäden induziert. Ein wichtiges Ziel ist es daher, den Apoptoseprozess zu verhindern oder zu stoppen, um die geschädigten Nervenzellen vor dem Absterben zu bewahren. In diesem Kontext hat die siRNA-basierte Gentherapie ein großes Potenzial zur Induktion von Neuroprotektion, indem sie auf Gene abzielt, die für Apoptoseprozesse verantwortlich sind. Allerdings werden siRNA-basierte Therapien hauptsächlich für die Behandlung von Lebererkrankungen eingesetzt und nicht für die in-vivo Neuroprotektion. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei polymere Nano-Trägerplattformen mit dem Ziel untersucht, das ZNS zu erreichen. Ziel der ersten Studie war zunächst, funktionalisierte Polyvinylpyrrolidon-Nanopartikel (PVP-NPs) zur Überwindung der Blut-Retina-Schranke - die die Situation an der BHS widerspiegelt - anhand eines Rattenmodells für die in-vivo-Netzhautdarstellung untersucht. In der zweiten Studie wurden Poly(butylcyanoacrylat)-Nanopartikel (PBCA-NPs) als Nanocarrier für die Verabreichung von Caspase-3-siRNA in der in vivo Retina untersucht. Ziel dieses Ansatzes war es, die Apoptose von retinalen Ganglienzellen nach Schädigung durch in vivo Bildgebung der Netzhaut zu hemmen. PVP-NPs wurden mit hydrophoben Fluoreszenzmarkern (Dil und FITC) als Surrogat für hydrophobe Medikamente beladen und intravenös in die Schwanzvene von Ratten injiziert. PVP-Dil-CFSE-NPs hatten eine Partikelgröße von 344 nm und ein negatives Zetapotential von -15 mv. Die Ergebnisse des Experiments deuten darauf hin, dass die Bindung des hydrophoben Fluoreszenzmarkers (Carboxyfluoresceinsuccinimidylester) CFSE an die Oberfläche von PVP-NPs ihre Passage in das retinale Gewebe induzieren kann. Darüber hinaus wurde eine signifikante Internalisierung der modifizierten NPs in Blutzellen beobachtet. Diese wurden durch eine ex-vivo Ganzkörper-Retina-Visualisierung sichtbar gemacht. Andererseits wurde in PBCA NPs (CaspNPs) verkapselte Caspase-3 siRNA mit einer Partikelgröße von 143 nm, einem Polydispersitätsindex (PDI) von 0,26 und einem negativen Zetapotential von -9,87 mv produziert. Die Spezifikation der leeren PBCA-NPs betrug 124,08 nm, 0,26 PDI und -11,96 mv. Um die Auswirkungen in-vivo zu testen, wurde in dieser Studie ein Modell zur Quetschung des Sehnervs der Ratte (ONC) verwendet. Lädierte Zellen wurden entweder mit CaspNPs oder mit leeren PBCA-NPs behandelt, die durch intravitreale Injektion in das Auge eingebracht worden waren. Wiederholte Zählungen der retinalen Ganglienzellen durch konfokales Neuroimaging hat ergeben, dass der posttraumatische Zellverlust nach der CaspNPs-Injektion nur 36,1 % betrug gegenüber 63,4% bei den Kontrollgruppen. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass PVP NPs eine potentielle Nano-Carrier-Plattform darstellen, die es ermöglicht, das Gehirn getarnt durch Blutzellen zu erreichen. Die Ergebnisse der zweiten Studie deuten darauf hin, dass CaspNPs als potenzielles therapeutisches Mittel zur Verringerung des Zelltods von Neuronen der Retina dienen können, was neue Perspektiven für die Neuroprotektion oder Neuromodulation von Funktionsstörungen des Zentralnervensystems bei neurologischen Erkrankungen eröffnet. Obwohl die vivo-Experimente mit Ratten vielversprechende Beweise dafür liefern, dass NPs Medikamente und Gene in das ZNS transportieren können, sind weitere präklinische und klinische Studien notwendig, um diese Ergebnisse zu verifizieren.