The role of Piccolo and Bassoon in the regulation of voltage-gated calcium channels at presynaptic neurotransmitter release sites

Abstract

The active zone is the region of the presynaptic membrane where neurotransmitter release takes place. This region is characterized by a dense meshwork of proteins called the cytoma-trix at the active zone (CAZ). Proteins of the CAZ define the release sites, localize to voltage-gated calcium channels (VGCC) within the presynaptic membrane, and coordinate the exo- endocytotic events during the synaptic vesicle cycle. These processes enable fast and reliable neurotransmission. Bassoon and Piccolo are large components of the CAZ, highly homolo-gous, implicated in these processes. Both have been reported to be important for correct neu-rotransmission. The lack of one or both scaffolding proteins results in a failure of the presyn-aptic function. However, their implication in the processes governing the neurotransmitter release is not fully understood. Rim-binding proteins (RBPs), other components of the CAZ, have been shown to be important for the neurotransmission in multiple ways. Despite the reported interaction between Piccolo and Bassoon with RBPs, the functional consequences are not well known. In this study, using whole-cell voltage clamp recordings and imaging techniques of mature hippocampal wild-type and Piccolo-mutant neurons, I observed that Piccolo is important for a correct presynaptic function in these neurons. Based on imaging techniques, I determined that Piccolo mutant synapses have lower synaptic strength, although the synaptogenesis is not impaired. I reported RBP2 as a binding partner of Piccolo, which has been shown to functionally and structurally link presynaptic proteins to VGCC. Func-tional analysis of presynaptic calcium income showed that the VGCC recruitment and con-tribution to synaptic transmission are not affected in Piccolo-mutant neurons. Nevertheless, the synaptic vesicle (SV) recycling is impaired. Whereas the size readily releasable SV pool is not significantly changed, the recycling pool is decreased, most likely, due to an impair-ment in the Rab3-mediated SV replenishment, but not to a defect in the SV endocytosis. On the other hand, I found some unique and some overlapping functions of Bassoon compared to Piccolo. Surprisingly the absence of Bassoon increases presynaptic calcium influx. Aside from the fact that the mechanisms are not clear yet, my data suggest that Bassoon modulates the contribution of VGCC subtypes. Furthermore, I showed that SV recycling is decreased in Bassoon-lacking neurons. Changes in the global network activity induce homeostatic adaptations of synapses, which involve pre- and postsynaptic adaptations. While the molecular players contributing to postsynaptic homeostasis are well understood, less is known about the effectors maintaining presynaptic homeostasis. In the second part of the thesis, the role of Bassoon and Piccolo after prolonged silencing in hippocampal neurons was studied. Using imaging techniques, I observed that Bassoon, but not Piccolo, impairs evoked presynaptic calcium income after prolonged silencing, while both seem to regulate SV recycling. Furthermore, since no signif-icant changes were observed in the surface population of AMPA receptors of Bassoon-lack-ing neurons, I hypothesized that the functional consequences of Bassoon are, most likely, restricted to the presynaptic compartment. The data suggest that despite Bassoon has a more active role in homeostasis than Piccolo, both scaffolds are crucial for homeostatic plasticity mechanisms in the mammalian hippocampus. Overall, these findings provide new insights into the mechanisms contributing to neurotrans-mission and synaptic plasticity.

Bei der aktiven Zone (AZ) von Nervenzellen handelt es sich um eine Region der Präsynap-semembran, an der die Ausschüttung von Neurotransmittern stattfindet. Diese Region ist durch ein dichtes Netzwerk von Proteinen, die sogenannte Cytomatrix an der aktiven Zone (CAZ), charakterisiert. Proteine in dieser Zone definieren die Areale der Neurotransmitter-ausschüttung, sind mit spannungsgesteuerten Kalzium-Kanälen (VGCC) innerhalb der prä-synaptischen Membran kolokalisiert und koordinieren exo-endozytotische Prozesse während des synaptischen Vesikel-Kreislaufs. Diese Prozesse ermöglichen eine schnelle und zuver-lässige Übertragung von Neurotransmitter-Signalen. Wichtige Proteine für diese Prozesse sind Bassoon und Piccolo, strukturell verwandte große Komponenten der CAZ. Es konnte gezeigt werden, dass diese beiden Proteine wichtig für eine korrekte Ausschüttung der Neu-rotransmitter aus der Präsynapse sind. So führt bereits der Verlust eines der beiden Gerüst-proteine zur Fehlfunktion der Präsynapse. Dennoch ist ihre Bedeutung für die Prozesse, die die Neurotransmitterausschüttung steuern, noch nicht vollkommen verstanden. Für Rim-bin-dende Proteine (RBPs), weitere Komponenten der CAZ, konnte bereits gezeigt werden, dass sie für die Übertragung von Neurotransmittern eine wichtige Bedeutung haben. Obwohl be-reits bekannt ist, dass Piccolo und Bassoon mit RBPs interagieren, sind die funktionellen Auswirkungen dieser Interaktion nicht völlig aufgeklärt. In dieser Studie habe ich unter Ver-wendung von elektrophysiologischen und mikroskopischer Methoden an neuronalen Primär-kulturen zeigen können, dass Piccolo-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp (WT) präsynap-tische Dysfunktionen aufweisen. Die Analyse von mikroskopischen Imagingdaten zeigt, dass Piccolo-Mutanten eine verringerte synaptische Stärke haben, während die Synaptogenese un-verändert ist. Ich konnte zeigen, dass RBP2 an Piccolo bindet und dass diese Interaktion ent-scheidend für die strukturelle und funktionelle Kopplung der präsynaptischen Proteine mit den VGCC ist. Funktionelle Analysen von präsynaptischen Kalziumströmen zeigen, dass die Rekrutierung von VGCC und die synaptische Signalweiterleitung in Neuronen von Piccolo-Mutanten nicht beeinträchtigt sind, jedoch das Recycling von synaptischen Vesikeln (SV) beeinflusst wird. Die Größe des sofort freisetzbaren SV-Pools ist unverändert, allerdings ist der sogenannte Recycling-Pool aufgrund einer Störung der Rab3-Protein-vermittelten Wie-derauffüllung, aber nicht wegen eines Defekts in der SV-Endozytose, verringert. Ich konnte zeigen, dass Bassoon teilweise ähnliche Funktionen wie Piccolo, teilweise aber auch ver-schiedene hat. Überraschenderweise weisen Bassoon-Mutanten einen erhöhten präsynapti-schen Kalziumeinstrom auf. Obwohl der genaue Mechanismus noch nicht klar ist, weisen die Daten dieser Dissertation darauf hin, dass Bassoon die Funktion verschiedener VGCC-Sub-typen moduliert. Des Weiteren zeigt die Arbeit, dass das Recycling von SV in Neuronen von Bassoon-Mutanten verringert ist. Veränderungen in der globalen Netzwerkaktivität führen zu homöostatischen Anpassungen in Synapsen, welche prä- und postsynaptisch sein können. Während die molekularen Fakto-ren, welche die postsynaptische homöostatischen Verstärkung regulieren, bereits gut unter-sucht sind, sind die der präsynaptischen Prozesse weniger gut bekannt. Im zweiten Teil der Dissertation habe ich deshalb die Rolle von Piccolo und Bassoon in hippocampalen Neuronen nach längerer Inkubation mit dem Natriumkanalblocker Tetrodotoxin (TTX) untersucht. Mit-hilfe mikroskopischer Bildgebung habe ich beobachten können, dass Bassoon, nicht jedoch Piccolo, nach längerer Stilllegung der Netzwerkaktivität die präsynaptischen Kalziumströme verringert. Jedoch scheinen beide Proteine das Recycling der SV in stillgelegten Synapsen zu regulieren. Da wir in Neuronen von Bassoon-Mutanten keine Verringerung der AMPA-Re-zeptoren an der Zelloberfläche feststellen konnten, vermuten wir, dass die homöostatische Anpassung präsynaptisch erfolgt. Unsere Daten lassen vermuten, dass - obwohl Bassoon eine aktivere Rolle bei der homöostatischen Anpassung spielt - beide Proteine wichtig für die ho-möostatischen Plastizität im Hippocampus von Säugetieren sind. Zusammenfassend geben die vorgelegten Daten neue Einblicke in die Mechanismen der neu-ronalen Signalübertragung und homöostatischen Plastizität.