Elucidating the role of the adhesion and degranulation-promoting adaptor protein (ADAP) in innate immune cells during Listeria monocytogenes infection in mice

Abstract

The adhesion and degranulation-promoting adaptor protein (ADAP) serves as a multifunctional scaffold and is involved in the formation of immune signaling complexes. To date only limited and moreover conflicting data exist regarding the role of ADAP in innate immune cells and its contribution in antibacterial immunity during in vivo infection remains largely elusive. The first part of this thesis extends existing knowledge on the role of ADAP in NK cells to in vivo infection with the intracellular pathogen Listeria monocytogenes (Lm). Ex vivo analysis of infection-primed NK cells revealed impaired cytotoxic capacity in NK cells lacking ADAP (ADAPko), indicated by reduced CD107a surface expression and inefficient perforin production. However, ADAP-deficiency had no global effect on NK cell morphology or intracellular distribution of CD107a-containing vesicles. Proteomic definition of ADAPko and wild type NK cells did not uncover obvious differences in protein composition during the steady state and similar early response patterns were induced in NK cells upon infection independent of genotype. In line with protein network analyses that suggested an altered migration phenotype in naïve ADAPko NK cells, in vitro migration assays uncovered significantly reduced migration of both naïve as well as infection-primed ADAPko NK cells compared to wild type NK cells. In conclusion, during systemic Lm infection in mice ADAP is essential for efficient cytotoxic capacity and migration of NK cells. The second part of the thesis builds on previous, so far unpublished data from our group showing that ADAPko mice are highly susceptible to infection with Lm. Enhanced immunopathology in infected tissues and an overall increased morbidity and mortality was associated with an excessive infiltration of neutrophils and inflammatory monocytes. Despite high phagocyte numbers in spleen and liver, ADAPko mice only inefficiently controlled pathogen growth hinting at a functional impairment of infection-primed phagocytes. Indeed, flow cytometric analysis of hallmark pro-inflammatory mediators and whole genome transcriptional profiling of neutrophils and inflammatory monocytes uncovered broad molecular alterations in the inflammatory program following their activation in the ADAP-deficient host. Strikingly, ex vivo phagocytosis assay revealed impaired phagocytic capacity of neutrophils derived from Lm-infected ADAPko mice. Together these data suggest that an alternative priming of phagocytes in ADAP-deficient mice during Lm infection induces marked alterations in the inflammatory profile of phagocytes that contributes to enhanced immunopathology while at the same time limits their capacity to eliminate the pathogen and to prevent the fatal outcome of the infection.

Das Adapterprotein ADAP (adhesion and degranulation-promoting adapter protein) ist als multifunktionales Protein an der Bildung von Immunsignalkomplexen beteiligt. Bis heute existieren nur begrenzte und darüber hinaus widersprüchliche Daten bezüglich der Rolle von ADAP in Zellen des angeborenen Immunsystems und dessen Beitrag zur antibakteriellen Immunität während einer in vivo Infektion bleibt weitgehend unklar. Der erste Teil dieser Dissertation erweitert das vorhandene Wissen bezüglich der Rolle von ADAP in NK-Zellen durch Nutzung eines in vivo Infektionsmodells mit dem intrazellulären Pathogen Listeria monocytogenes (Lm). Ex vivo Analysen von ADAP-defizienten (ADAPko) NK-Zellen, die im Rahmen der Lm Infektion in vivo aktiviert wurden, ergaben eine verminderte zytotoxische Funktion, welches durch eine reduzierte CD107a-Oberflächen-expression und eine ineffiziente Perforinproduktion angezeigt ist. Der Verlust von ADAP hatte jedoch keine globalen Auswirkungen auf die NK-Zellmorphologie oder die intrazelluläre Verteilung von CD107a-haltigen Vesikeln. Proteomische Untersuchungen von ADAPko und Wildtyp NK-Zellen ergaben keine offensichtlichen Unterschiede in der Proteinzusammen-setzung. In Übereinstimmung mit Proteinnetzwerkanalysen, die einen veränderten Migrations-phänotyp in naiven ADAPko NK-Zellen nahelegten, zeigten vergleichende in vitro Migrationstests eine signifikant reduzierte Migration sowohl von naiven als auch von infektionsaktivierten ADAPko NK-Zellen. Zusammenfassend lässt sich aus diesen Ergebnissen schließen, dass ADAP im Verlauf einer systemischen Lm Infektion für eine effiziente zytotoxische Funktion und Migration von NK-Zellen essentiell ist. Der zweite Teil der Dissertation baut auf früheren, bislang unveröffentlichten Daten unserer Arbeitsgruppe auf, die zeigen, dass ADAPko Mäuse sehr anfällig für Infektionen mit Lm sind. Eine verstärkte Immunpathologie in infizierten Geweben und eine insgesamt erhöhte Morbidität sowie Mortalität waren mit einer übermäßigen Infiltration von Neutrophilen und Monozyten verbunden. Trotz hoher Anzahl an Phagozyten kontrollierten ADAPko Mäuse das Pathogenwachstum nur ineffizient, was auf eine funktionale Beeinträchtigung der Phagozyten hindeutet. Tatsächlich zeigten durchflusszytometrische Analyse typischer pro-inflamma-torischer Mediatoren sowie Transkriptiomanalysen von Neutrophilen und inflammatorischen Monozyten molekulare Veränderungen nach Aktivierung im ADAP-defizienten Wirt auf. Bemerkenswerterweise ergab der ex vivo Phagozytosetest eine beeinträchtigte Phagozytose-leistung von Neutrophilen, die von Lm-infizierten ADAPko-Mäusen stammten. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass eine alternative Aktivierung von Phagozyten in ADAP-defizienten Mäusen während einer Lm Infektion deutliche Veränderungen im Entzündungsprofil und der Funktionalität von Phagozyten induziert, wodurch die Fähigkeit zur Eliminierung des Pathogens und somit zur Verhinderung des tödlichen Ausganges der Infektion eingeschränkt wird.