Etablierung eines Messsystems zur einzelmolekülsensitiven Analyse von Protein-Monoschicht-Interaktionen am Beispiel von Sar1p

Abstract

In dieser Arbeit wurde ein Messsystem etabliert, das es erlaubt, Interaktionen von Proteinen mit Phospholipid-Monoschichten an einer Langmuir-Filmwaage auf Basis einzelmolekülsensitiver Techniken wie Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) zu untersuchen. Hierzu wurde eine Variante der GTPase Sar1p mit einem Fluoreszenzfarbstoff modifiziert. Diese war mit dem Wildtyp-Enzym hinsichtlich der enzymatischen Aktivität, der Interaktion mit weiteren Proteinen des COPII-Komplexes sowie der Fähigkeit, Membranen morphologisch zu verändern, vergleichbar. Die Interaktionsexperimente wurden an zwei verschiedenen Lipidzusammensetzungen durchgeführt. Bei einer für die COPII-Bindung optimierten, ER-ähnlichen Zusammensetzung zeigte sich eine Interaktionsfläche von Sar1p, die zur Insertion der N-terminalen amphipathischen -Helix in die Lipidmonoschicht passt. Bei einer einfachen DLPC/DLPS-Mischung wurde hingegen eine Fläche erhalten, die sich mit der Insertion des gesamten Proteins erklären lässt.

In this work, a measurement system was established that allows the study of interactions of proteins with phospholipid monolayers on a Langmuir film balance, based on single-molecule sensitive techniques such as fluorescence correlation spectroscopy (FCS). To this end, a variant of the GTPase Sar1p was modified using a fluorescent dye. The labeled variant was comparable to the wild-type enzyme in terms of enzymatic activity, interaction with other proteins of the COPII complex, and remodeling of membrane morphology. The interaction experiments were performed on monolayers of two different lipid compositions. An ER-like composition optimized for COPII binding showed a molecular interaction area of Sar1p that is in agreement with an insertion of the N-terminal amphipathic α-helix. In contrast, a simple DLPC/DLPS mixture yielded an area value that can be explained by the insertion of the entire protein.