Participation of OMCA-neuroplastin complexes in neuronal Ca 2+ regulations, signaling and plasticity

Abstract

The calcium ion (Ca2+) is a second messenger responsible for the initiation and expression for multiple forms of synaptic plasticity in neurons. The plasma membrane Ca2+ ATPase (PMCA) plays a capital role in Ca2+ clearance which is essentially important for intracellular Ca2+ homeostasis. Recent studies have shown that PMCA forms protein complexes with the glycoprotein Neuroplastin which leads to the stabilization of the calcium pump in the plasma membrane. In fact, in Neuroplastin-deficient mutant mice, the protein levels of the PMCA isoforms are downregulated along with the occurrence of an impaired synaptic plasticity. However, the importance of PMCA-Neuroplastin complex function in Ca2+ clearance and plasticity remained unrevealed. In my thesis, I focus on the role of PMCA-Neuroplastin complexes in Ca2+ regulation and downstream signaling ultimately associated to plastic changes in dendrites and spines of mature hippocampal neurons. I characterized high-frequency stimulation (HFS)-induced structural plasticity and PMCA-Neuroplastin levels using immunocytochemistry, confocal microscopy and live-cell calcium imaging, Neuroplastin65 overexpression and several pharmacological reagents to confirm the hypothesis that PMCA-Neuroplastin complexes regulate Ca2+ clearance in dendrites and spines during low and high levels of neuronal activity. Using super resolution STED microscopy and live-cell calcium imaging, I found that the synaptic localization and also function of PMCA-Neuroplastin complexes require ionotropic glutamate receptor activity. Supporting the link between PMCA-Neuroplastin complexes and ionotropic glutamate receptors, PMCAs and GluN2A-containing N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR2A) levels were reduced in the hippocampus of Neuroplastin-deficient mutant mice. Further, I studied Ca2+-mediated downstream events and could show that PMCA-Neuroplastin complexes modulate the phosphorylation of downstream signaling molecules, i.e., extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II alpha (CaMKIIα) using PMCA inhibitors, immunocytochemistry and STED microscopy. ERK1/2 phosphorylation was increased in the hippocampus of Neuroplastin-deficient mutant mice. In this thesis, I also tested the effect of the pro-inflammatory cytokine tumor-necrosis factor-alpha (TNF-α) on Ca2+ restoration and found altered HFS-induced or spontaneous Ca2+ transients upon TNF-α treatment. Taken together, PMCA-Neuroplastin complexes are closely linked with ionotropic glutamate receptors regulating their localization and function. The participation of PMCA-Neuroplastin complexes in Ca2+ regulation and Ca2+-dependent signaling serves a candidate mechanism underlying activity-dependent synaptic plasticity.

Das Calzium-Ion (Ca2+) ist ein sekundärer Botenstoff, welcher verantwortlich ist für die Initiierung und Ausprägung diverser Formen von synaptischer Plastizität in Neuronen. Die Plasma Membrane Ca2+ ATPase (PMCA) spielt eine zentrale Rolle in der Extrusion von Ca2+, welche von essentieller Bedeutung für die intrazelluläre Calcium-Homöostase ist. Neuste Studien zeigen, dass PMCA mit dem Glycoprotein Neuroplastin Proteinkomplexe formt, welche zur Stabilisation der Kalzium-Pumpe in der Plasmamembran führen. In Neuroplastin-defizienten Mäusen ist das Proteinniveau von PMCA-Isoformen tatsächlich herunterreguliert, und die synaptische Plastizität ist beeinträchtigt. Welche funktionelle Bedeutung der PMCA-Neuroplastin-Komplex für die synaptische Ca2+ -Clearance und Plastizität hat, ist jedoch bisher unbekannt. In der vorliegenden Arbeit fokussiere ich mich auf die Rolle des PMCA-Neuroplastin-Komplexes in der Ca2+-Regulation und dem nachfolgenden Signalweg, welcher mit plastischen Veränderungen in Dendriten und Spines (zu Deutsch „Dornenfortsatz“) in maturen hippocampalen Neuronen assoziiert ist. Um meine Hypothese zu verifizieren, dass PMCA-Neuroplastin-Komplexe die Ca2+-Extrusionin Dendriten und Spines während niedriger und hoher neuronaler Aktivität regulieren, charakterisierte ich die durch Hochfrequenzstimulation induzierte strukturelle Plastizität und PMCA-Neuroplastin-Level durch die Anwendung von Immunzytochemie, konfokaler Mikroskopie und Life Cell-Calzium-Imaging, Neuroplastin-Überexpression und Pharmakologie. Mittels hochauflösender STED-Mikroskopie und Life Cell-Calzium-Imaging konnte ich herausfinden, dass die synaptische Lokalisierung und Funktion des PMCA-Neuroplastin-Komplexes die Aktivierung ionotroper Glutamatrezeptoren benötigt. Im Hippocampus von Neuroplastin-defizienten Mäusen waren die Mengen an PMCAs und GluN2A-enthaltenden N-methyl-D-aspartat-Rezeptoren (NMDAR2A) reduziert, was eine Verbindung zwischen den PMCA-Neuroplastin-Komplexen und ionotropen Glutamatrezeptoren unterstützt. Des Weiteren untersuchte ich Ca2+-gesteuerte intrazelluläre Signalwege und konnte mittels PMCA-Inhibitoren, Immunzytochemie und STED Mikroskopie zeigen, dass PMCA-Neuroplastin-Komplexe die Phosphorylierung der nachgeschalteten extrazellulären Signal-regulierten Kinase 1/2 (ERK1/2) und Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II alpha (CaMKIIα) regulieren. Die ERK1/2-Phosphorylierung war im Hippocampus der Neuroplastin-defizienten Mäuse erhöht. In meiner Arbeit testete ich auch den Effekt des pro-inflammatorischen Zytokins Tumor-Nekrose Faktor-Alpha (TNF-α) bei der synaptischen Ca2+-Clearance und entdeckte in TNF-α-behandelten Neuronen veränderte Ca2+-Transienten sowohl nach hochfrequenter Stimulation als auch bei spontaner Aktivität. Zusammengenommen zeigt meine Arbeit eine funktionelle Verknüpfung von synaptischen PMCA-Neuroplastin-Komplexen mit ionotropen Glutamatrezeptoren, welche die Lokalisation und Funktion der PMCA regulieren. Die Beteiligung von PMCA-Neuroplastin-Komplexen in der Ca2+-Regulierung und der Ca2+-abhängigen Signalgebung könnte einen Kandidaten-Mechanismus für die aktivitätsabhängige synaptische Plastizität darstellen.