Biophysikalische Charakterisierung der Isoformen von Drosophila melanogaster Spätzle, einem NGF-ähnlichen Protein der Familie der Cystinknoten

Abstract

Spätzle ist in der embryonalen Entwicklung der Dorsal-Ventral-Achse sowie in der angeborenen Immunantwort in Drosophila melanogaster als Ligand des Toll Rezeptors involviert. Nach Auslösung einer proteolytischen Kaskade wird Spätzle durch spezifische Serinproteasen aktiviert. Das resultierende Proteolysefragment ist die Cystinknoten-Domäne, welche homolog zu der reifen Form des menschlichen Nervenwachstumsfaktor ist. Das Gen spz wird durch alternatives Spleißen in zehn Isoformen variiert, die sich (mit Ausnahme der Propeptid Isoform) in der Cystinknoten-Domäne ähneln, aber in den Propeptiden unterscheiden. Die Diversität der Spätzle Isoformen kann in einer zusätzlichen Funktion des Propeptides begründet sein. Die Spätzle Isoformen wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und nach Bedarf in vitro gefaltet. Die Propeptid Isoform wurde löslich exprimiert und war nach CD- und NMR-Messungen unstrukturiert. Die Isoformen mit Cystinknoten-Domäne wurden aus inclusion bodies in vitro renaturiert. Die funktionellen Isoformen retteten Spätzle-defiziente Embryonen und zeigten ähnliche CD-Spektren, unterschieden sich aber in der Tryptophan-Fluoreszenz durch verschiedene Interaktion des Tryptophans mit dem entsprechenden Propeptides. Die Kristallstruktur der Cystinknoten-Domäne zeigte ein T-förmiges Dimer mit hohen β-Faltblattgehalt und der typischen Disulfidverbrückung. Die Ergebnisse sprechen für eine gegenseitige Stabilisierung der Tertiärstruktur des Propeptides mit der Cystinknoten-Domäne.