Die Pyrrol-2-carboxylat-Monooxygenase von Arthrobacter spec. Py1, eine Flavin-abhängige Vier-Komponenten-Monooxygenase

Abstract

Pyrrol-2-carboxylat (P2C) ist ein N-haltiger Heterozyklus, den Arthrobacter spec. Py1 als alleinige N-, C- und Energiequelle nutzen kann. In dieser Arbeit wurden die Gene reg, mem, nit, pycA, pycB, pycC und pycD, deren Produkte möglicherweise am Abbau von P2C beteiligt sind, identifiziert, sequenziert und schließlich als pyc-Gencluster bezeichnet. Ähnliche Gencluster konnten in Arthrobacter aurescens TC1, Nocardia farcinica IFM10152 und Rhodococcus koreensis gefunden werden. Bis auf reg konnten für alle Gene des pyc-Genclusters P2C-induzierte Transkripte nachgewiesen werden. Anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenzen konnten für die Genprodukte mögliche Funktionen im P2C-Katabolismus postuliert werden. Reg stellt ein Regulatorprotein der GntR-Familie dar, dass die Transkription des pyc-Genclusters regulieren könnte. Mem zeigte die höchsten Identitäten zu Transportproteinen und stellt möglicherweise den P2C-Transporter dar. Nit, eine Amidase, könnte den weiteren Abbau des 5-Hydroxypyrrol-2-carboxylat, einem Zwischenprodukt des P2C-Abbaus, katalysieren. PycA zeigte die höchste Identität zu Monooxygenase-Komponenten und PycB zu Reduktase-Komponenten von Flavin-abhängigen Monooxygenasen. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von pycC und pycD zeigten hohe Ähnlichkeiten zu den Genprodukten von offenen Leserahmen, die in der unmittelbaren Nachbarschaft von Monooxygenase-Genen liegen. PycA, pycB, pycC, and pycD wurden in E. coli mit einem StrepTag heterolog exprimiert und näher charakterisiert. PycAC und PycBC katalysieren gemeinsam den P2C-Abbau. Die NADH-abhängige Reduktase PycBC stellt FADH2 zur Verfügung, welches von der Monooxygenase PycAC zur Hydroxylierung des P2C genutzt wird. In Anwesenheit von PycCC und PycDC stieg die P2C-Abbaurate deutlich an. Es konnte gezeigt werden, dass PycCC und PycDC in der Lage sind reduziertes FAD vor der Oxidation durch molekularen Sauerstoff zu schützen. Dadurch steht PycAC mehr reduziertes Flavin für die P2C-Hydroxylierung zur Verfügung, was schließlich zu einer deutlichen Steigerung der P2C-Abbaurate führt. Es konnte somit ein neuer Schutzmechanismus gegen die Entkopplung der Flavinreduktion gefunden werden. Bis jetzt stellt die P2C-Monooxygenase von Arthrobacter spec. Py1 den Prototypen einer neuen Gruppe von Flavin-abhängigen Vier-Komponenten Monooxygenase dar.