Biochemische, kinetische und strukturelle Untersuchungen der Transaldolase aus Thermoplasma acidophilum

Abstract

Die Transaldolase (TA, EC 2.2.1.2) ist eines der Hauptenzyme des nichtoxidativen Teils des Pentosephosphatwegs und überträgt reversibel Dihydroxyacetoneinheiten von einem Ketosephosphat auf ein Aldosephosphat. Dies erfolgt nach einem Schiffbasen-Mechanismus unter Beteiligung eines katalytisch aktiven Lysinrests. Die während der Katalyse ablaufenden Protonentransferprozesse sollen von zwei sauren Resten (Asp, Glu) sowie einem katalytischen Wassermolekül im aktiven Zentrum realisiert werden, wobei vorgeschlagen wurde, dass der Aspartatrest die Bindungsspaltung durch Deprotonierung der C4-Hydroxylgruppe einleitet. In der vorliegenden Arbeit sollten Einzelschritte der Reaktion weiter aufgeklärt werden. Dafür wurde die TA aus dem thermophilen Archeon Thermoplasma acidophilum, eine TA der Unterfamilie 4, verwendet. Das Enzym wurde heterolog in Escherichia coli exprimiert, ein Reinigungsschema entwickelt und das gereinigte Enzym biochemisch charakterisiert. Der Einsatz verschiedener Methoden ermöglichte, neue Erkenntnisse über den Katalysemechanismus des Enzyms zu gewinnen. Neben kinetischen Studien kam die Röntgenkristallstrukturanalyse zur Anwendung, wobei die Struktur der TA von Wildtyp und Proteinvarianten im Grundzustand sowie in kovalenten und nichtkovalenten Intermediatkomplexen aufgeklärt werden konnte. Zusätzlich wurde ein massenspektrometrischer Assay zur Analyse der Intermediatverteilung im enzymgebundenen Zustand entwickelt. Anhand der Befunde wird ein abgeänderter Katalysemechanismus vorgeschlagen, bei dem der Glutamatrest durch Deprotonierung der C4-Hydroxylgruppe zur C3-C4-Bindungsspaltung des Donorsubstrats führt. Ein weiterer Befund ist das Auftreten von Proteindynamik, welche in Form einer geschlossenen und offenen Enzymform wichtig für die Substratbindung sein könnte.