Faltung und Dynamik von Onconase - Bedeutung eines konservierten Faltungsintermediats und der C-terminalen Disulfidbrücke

Abstract

Bis heute ist nicht bekannt, ob Proteine mit einer ähnlichen Tertiärstruktur auch vergleichbare Faltungsmechanismen aufweisen. Ein Ansatz zur Bestimmung des Einflusses der Tertiärstruktur auf den Faltungsmechanismus ist die Untersuchung von Proteinen mit niedriger Sequenzidentität bzw. -ähnlichkeit und einer vergleichbaren Tertiärstruktur. Onconase® (ONC, Alfacell Corporation, Somerset, NJ, USA) ist das kleinste und stabilste Mitglied der Ribonuclease A (RNase A) Superfamilie. Trotz einer Sequenzidentität von nur 28% sind die Tertiärstrukturen des Hauptvertreters dieser Strukturfamilie, der RNase A, und ONC weitgehend übereinstimmend. In der vorliegenden Arbeit wurde das Faltungsverhalten von ONC detailliert untersucht und mit bereits publizierten Erkenntnissen zur Faltung von RNase A verglichen. Mit Hilfe von manuellen bzw. stopped-flow Fluoreszenzmessungen, Einfach- und Doppelsprungexperimenten sowie Echtzeit-NMR-Experimenten wurden während der Faltung von ONC bis zu drei Rück- und zwei Entfaltungsreaktionen beobachtet. Alle kinetischen Daten konnten durch ein sequenzielles Faltungsmodell global angepasst und den einzelnen Faltungsreaktionen tatsächliche Faltungsereignisse zugeordnet werden. Demnach faltet ONC nach einer langsamen Peptidyl-prolylcis- zu-trans-Isomerisierungsreaktion im entfalteten Zustand schnell über ein Faltungsintermediat (IONC) sequenziell zum nativen Zustand. Mit Hilfe von quenched-flow-Experimenten in Kombination mit H/D-Austausch und 2D-NMR-Spektroskopie konnten Aussagen zum strukturellen Aufbau von IONC gemacht werden. Dabei wurde deutlich, dass IONC eine zu mindestens einem während der Faltung von RNase A auftretenden Intermediat vergleichbare Struktur aufweist. Dies zeigt, dass nicht nur die Tertiärstruktur der beiden homologen Proteine RNase A und ONC analog sind, sondern auch dass der Faltungsweg teilweise konserviert ist. Faltungsuntersuchungen an einer Variante von ONC, bei der die C-terminale Disulfidbrücke eliminiert wurde, was zu einer Verminderung der thermodynamische Stabilität um mehr als 30 kJ⋅mol-1 führt, verdeutlichten, dass diese Disulfidbrücke eine entscheidende Rolle für die Bildung von IONC während der Faltung von ONC spielt. Durch die röntgenkristallographische und NMR-spektroskopische Aufklärung der Raumstruktur dieser Variante sowie durch Dynamikstudien konnten mögliche Ursachen für die verminderte Aktivität und Stabilität sowie für das veränderte Faltungsverhalten der Variante im Vergleich zu ONC aufgeklärt werden.