Overexpression, purification and reconstitution of Tat subunits of Arabidopsis thaliana into liposomes

Abstract

Der ΔpH/Tat-abhängige Weg ist sehr ungewöhnlich, weil gefaltete Proteine transportiert werden können und dabei kein ATP für diesen Transportprozess erforderlich ist. Rekonstitution der Tat Proteine in die künstlichen Liposomen bietet eine Möglichkeit um die Mechanismus des ΔpH/Tat-abhängigen Weg zu erforschen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Tat Proteine in E.coli-Zellen überexprimiert und anschließend unter nativen oder denaturierenden Bedingungen gereinigt. Alternativ können Tat Proteine auch durch eine Zellfreie Translationssystem herstellt werden. Liposomen wurden mit sowohl Thylakoid-ähnlicher Lipidenkomposition als auch mit reiner PC hergestellt. PC-Liposomen, welche stabiler sind und einfacher hergestellt werden können, wurden zumeist für die primäre Analysis der Rekonstitution verwendet. In dieser Dissertation wurden die folgenden drei Methoden für die Rekonstitution der Tat-Proteine ins Liposomen erforscht: die spontane, die Detergens-vermittelte, und die kotranslationale Rekonstitution. Die Tat-Proteine wurden entweder separat oder zusammen als Proteinkomplex für die Rekonstitution eingesetzt.