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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/650
Title: Einsatz nativer Proteasen zur stereoselektiven Synthese von L- und D-konfigurierten Proteinen
Author(s): Pech, Andreas
Advisor(s): Bordusa, Frank, Prof. Dr.
Golbik, Ralph, Dr.
Becker, Christian, Prof. Dr.
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2011
Extent: Online-Ressource (154 Bl. = 3,78 mb)
Type: Hochschulschrift
Exam Date: 21.04.2011
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3:4-7266
Subjects: Online-Publikation
Hochschulschrift
Abstract: Die chemische Synthese von längerkettigen Peptiden, Proteinen oder gar aktiven Enzymen stellt noch immer eine Herausforderung dar. Dies gilt besonders dann, wenn gleichzeitig ein gerichteter Einbau von nicht-proteinogenen Aminosäuren erfolgen soll. In der vorliegenden Dissertation wird einerseits die Synthese eines all-D-Proteins unter Verwendung einer L-spezifischen Protease und andererseits die Darstellung eines all-L-Proteins mit dem erstmaligen Einsatz einer D-spezifischen Protease beschrieben. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese des verkürzten all-D-HMGA 1b-Proteins, welches aus 81 Aminosäuren besteht. Zentraler Bestandteil war die Optimierung der Festphasensynthese der Peptidsegmente. Hierfür wurden verschiedene Synthese-strategien untersucht. Nach erfolgreicher Synthese sind die entsprechenden Peptide 4-Guanidinophenylester überführt worden. Anschließend erfolgte die Optimierung der jeweiligen enzymatischen Clostripain-katalysierten Ligationsreaktionen, die Produkt-isolierung und -charakterisierung. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die D-Phe-spezifische Alkalische D-Peptidase aus Bacillus cereus (ADP) auf ihre potentielle Fähigkeit zur Verknüpfung von all-L Peptiden zur Darstellung längerkettiger Peptide und Proteine untersucht. Nach initialen Studien zur Akzeptanz ausgewählter Substratmimetika durch die Protease konnte in enzymatischen Ligationsreaktionen erstmals gezeigt werden, dass die ADP Substratmimetika-vermittelt zwei Aminosäuren in der L-Konfiguration miteinander verknüpfen kann. Nachfolgende Experimente mit synthetisch hergestellten peptidischen Substratmimetika und Nukleophilen ergaben, dass Enzym neben Aminosäure- auch Tri- und Dekapeptid-OGp-Ester mit Nukleophilen, bestehend aus 10 bzw. 16 Aminosäuren, effizient miteinander zu verknüpfen und daher vermutlich noch größere Fragmente miteinander ligieren könnte. Als Modell für längerkettige Substrate wurde das aus 92 Aminosäuren bestehende E. coli Parvulin 10 gewählt, wobei zunächst die Synthese der Segmente Z-Ala1-Lys35-OBzl sowie H-Lys36-Asn92-OH Voraussetzung war. Im Anschluss an die erfolgreiche Festphasensynthese ist die Ligation der Segmente mit der ADP durchgeführt worden, wobei aufgrund der D-Phe-Spezifität der Protease keine proteolytische Spaltung des Ligationsprodukts detektiert wurde. Abschließend erfolgten CD-spektroskopische Untersuchungen und die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des synthetischen Parvulins.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/7550
http://dx.doi.org/10.25673/650
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Biochemie

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