Virus-analoge Partikel des Polyomavirus - Produktion in Hefe und biophysikalische Charakterisierung

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, Polyoma VLPs (MuPyV) rekombinant in der nicht konventionellen Hefe Kluyveromyces lactis im mg L-1-Maßstab durch Hochzelldichtefermentation zu produzieren. Wie auch während der Produktion in anderen eukaryotischen Systemen assemblierte VP1 bereits in den Hefezellen zu VLPs (in vivo). Ein Vergleich dieser in vivo assemblierten VLPs mit konventionell in vitro assemblierten VLPs zeigte, dass in vivo assemblierte VLPs (I) eine durch Disulfid bedingte höheren Schutz vor Proteasen besitzen, (II) eine höher thermische Stabilität aufweisen, (III) langsamer und mit einer höheren Aktivierungsenthalpie disassemblieren, (IV) zusätzliche Elektronendichten (Kryo-EM) an den N-terminalen Regionen der Untereinheiten zeigen, (V) und auch zusätzliche terminale Disulfidvernetzungen besitzen. Die höhere Stabilität der VLPs korreliert hier mit hoch geordneten und disulfidverbrückten terminalen Regionen der Untereinheiten der VLPs.

This thesis characterizes VLPs which were recombinantly produced upon high-cell density fermentation of the non-conventional yeast Kluyveromyces lactis at a mg L-1 level. As in other eucaryotic systems VLPs assemble intracellularly in the yeast cells (in vivo). In comparison to in vitro assembled VLPs structural and biophysical analysis demonstrated that yeast derived VLPs (I) have a higher proteolytic resistance against trypsin which is determined by disulfide bonds, (II) have a higher thermal stability, (III) have a slower disassembly with higher activation enthalpy, (IV) exhibit additional electron densities in single particle reconstructions (Cryo-EM) in the interior of the VLPs at the terminal regions and (V) and possess additional disulfide crosslinks at the N-terminal regions. This suggests highly ordered terminal regions of yeast derived VLPs which are crucial for pentamer-pentamer interactions within the VLPs, probably resulting in a higher stability of these VLPs.