Rekonstitution des humanen Parathormon Rezeptors (PTHR1) in Liposomen

Abstract

PTHR1 konnte rekombinant in E. coli als inclusion bodies mittels fed-batch Fermentation produziert werden. Die Ausbeute an Biofeuchtmasse betrug 1,7 kg aus 8 L Fermentationsansatz. Aus den Zellen konnte durch etablierte Protokolle 170 g inclusion bodies extrahiert werden. Diese konnte unter der Verwendung von dem anionischen Detergens SDS solubilisiert werden und ca. 1,6 g PTHR1 unter denaturierenden Bedingungen mittels IMAC gereinigt werden. Die Analyse mittels Circulardichroismus zeigte bereits das Spektrum eines α-helikalen Proteins. Der PTHR1 wurde mittels artificial chaperone System kombiniert mit einer rapid dilution Methode in einen argininhaltigen Puffer renaturiert. Die daraus resultierende geringe Proteinmenge wurde durch Konzentratoren auf 1 mg/ml konzentriert. Dieser mizellare PTHR1 wurde danach in Liposomen rekonstituiert und dessen erfolgreiche Integration in die Liposomen durch elektronenmikroskopische Gefrierbruchaufnahmen bestätigt. Erste Ligandenbindungstudien bestätigten, dass 260 mg des rekonstituierten PTHR1 einen fluoreszenzmarkierten Liganden binden konnten.

PTHR1 was recombinantely produced in Escherichia coli as inclusion bodies by fed-batch fermentation. The yield of the cell biomass was 1.7 kg. The cells were disrupted by a homogenizer and 10% inclusion bodies were isolated from the cells. The inclusion bodies were dissolved under denaturing conditions using the strong anionic detergent SDS and PTHR1 could be purified under denaturing condition by a single chromatography step. The analysis of the IMAC elution faction by CD spectroscopy indicated already a high alphahelical content of PTHR1. PTHR1 was applied to a refolding procedure on basis of the artificial chaperone system combined with rapid dilution into an arginine containing buffer. This led to an initially low protein concentration which was overcome by concentrator devices end up with a final protein concentration up to 1mg/ ml. Subsequently, the micellar PTHR1 was reconstituted in liposomes and analyzed via freeze-fracture electron microscopic pictures. Initial ligand binding studies confirmed that 260 mg of reconstituted PTHR1 were able to bind specific to fluorescent labelled PTH-ECFP with high affinity.