Modulation of the brain's hyaluronan-based extracellular matrix in mouse models of epilepsy

Abstract

Epilepsy is a common brain disorder which is characterised by recurrent electrographic seizures that affect the brain and the behaviour of patients. In order to better understand the pathophysiology underlying the epileptic phenotype, several animal models have been developed. A genetic model of epilepsy, a mouse mutant for the pre-synaptic active zone protein Bassoon, is known to develop seizures early in life while expressing a truncated version of Bassoon (Bsn1). Other lines of Bassoon mutants with constitutive mutations (Bgt & Bsn3) or conditional mutations in inhibitory (B2I) or excitatory neurons (B2E) are also available, but their epileptic phenotype is yet unevaluated. Seizures modify the morphology as well as the electrophysiology of neuronal networks, and they do so by acting on neuronal plasticity, cell migration, neurogenesis and synaptic activity. Among these various mechanisms, there are overlaps with the functions of the brain extracellular matrix (ECM), and more precisely the hyaluronic acid (HA)-based ECM which became recently a new research focus in mechanistic epilepsy research. Indeed, the ability of the brain ECM to regulate cell migration in early life as well as its control of synaptic plasticity in the mature brain and its more recently discovered ability to affect adult neurogenesis concerns processes in the central nervous system that are affected in epilepsy. Moreover, the dynamic meshwork of proteoglycans, chondroitin sulphate (CS), glycoproteins and HA that form the brain ECM undergoes a series of changes in epilepsy patients as well as in animal models. In the classical model of kainic acid (KA) injection, the peri-neuronal nets, a dense ECM structure around the inhibitory interneurons, are digested following seizures. Furthermore, some ECM components characteristic for the mature brain are down-regulated, while ECM molecules typically found in a juvenile brain are up-regulated. In the KA model, a change in the synaptic density of hippocampal neurons was reported, concomitant with the digestion of the proteoglycan Brevican. Based on previous findings in chemically induced models of epilepsy, I hypothesise that the state of the ECM is reflected in the severity and the strength of the seizures observed in long-lasting epilepsy. I evaluated this possible link in the different lines of Bassoon mutants. As a reference to established models, I also evaluated the reconstruction of the ECM in the KA-treated animals one and four weeks after injection. In order to evaluate the epileptic phenotype of the 5 different lines of Bassoon mutants, the EEG was recorded and the brains of the recorded animals were collected for the quantification of ECM components afterwards. I have used semi-quantitative Western Blot analyses, immunohistochemistry and proteomics and could show that the mutants for Bassoon, with the exception of the B2E line, systematically develop seizures and an epileptic phenotype in early-life that continues into adulthood, where they display more frequent seizures than the KA model. These seizures are concomitant with changes to the HA-based ECM in the brain. Notably there is a strong decrease in the amount of Brevican in the Bsn3 line, the one with the strongest epileptic phenotype. The B2I line is distinct from the others with an increase in Aggrecan, similar to the one week post KA injection model. Overall, among the Bassoon mutants, the amount of Brevican negatively correlates with the frequency of seizures, reinforcing the idea of a link between the ECM state and the epileptic phenotype. Applying immunohistochemistry to brain slices, I evaluated whether specific modifications of the ECM would occur in the hippocampus, a region known to be strongly affected in epilepsy. The ECM patterns were different between Bsn3 mutants and KA-injected animals, with the dentate gyrus of Bassoon mutants having high levels of WFA-positive CS whereas the WFA label accumulated in the CA1 sub-region of the hippocampus of KA-injected animals, suggesting CS was being digested. Taken together, the results of this thesis provide new information about the HA-based ECM in epilepsy, both for the KA model and for a new model of early-onset generalised epilepsy: the Bassoon mutants. In the Bassoon mutants, the ECM changes could be at the origin of several previously described phenotypes such as the increase in neurogenesis or modifications to the function of mossy fibres. These phenotypes are likely to be the cause of seizures as they are observed in other models of epilepsy, notably the KA-injected animals. Thus, it appears that the HA-based ECM could be a target for alleviating seizures through the regulation of other cell or network modifications happening in epilepsy.

Epilepsie ist eine häufig auftretende neurologische Erkrankung, die durch wiederkehrende elektrografische Anfälle gekennzeichnet ist und sowohl die Hirnfunktion als auch das Verhalten der betroffenen Patienten erheblich beeinträchtigt. Um die Pathophysiologie, die dem epileptischen Geschehen zugrunde liegt, besser zu verstehen, wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt. Ein genetisches Epilepsie-Modell , eine Mausmutante für das präsynaptisch aktive Zonen-Protein Bassoon (Bsn1), die eine abnorm verkürzte Version von Bassoon exprimiert, entwickelt früh im Leben epileptische Anfälle. Andere konstitutive Bassoon-Mutanten (Bgt und Bsn3) oder konditionale Mutanten mit Bassoon-Defizienz in inhibitorischen (B2I) oder exzitatorischen Neuronen (B2E) sind ebenfalls verfügbar, aber ihr epileptischer Phänotyp war bisher nicht charakterisiert. Epileptische Anfälle verändern sowohl die Morphologie als auch die Elektrophysiologie neuronaler Netzwerke, indem sie auf neuronale Plastizität, Zellmigration, Neurogenese und synaptische Aktivität einwirken. Beeinträchtigt ist dabei auch die extrazelluläre Matrix (EZM) des Gehirns, genauer gesagt die von Hyaluronsäure (HA) als Grundgerüst organisierte EZM, die in letzter Zeit zu einem neuen Forschungsschwerpunkt in der mechanistischen Epilepsieforschung geworden ist. In der Tat kontrolliert die EZM im sich entwickelnden Gehirn unter anderem die Migration von Neuronen und im reifen Gehirn die synaptische Plastizität, aber auch, wie erst kürzlich entdeckt, die Neurogenese – Prozesse im zentralen Nervensystem, die vom Epilepsiegeschehen wesentlich betroffen sind. Darüber hinaus erfährt das dynamische Geflecht aus Proteoglykanen, Chondroitinsulfat, Glykoproteinen und HA, das die EZM des Gehirns bildet, sowohl bei Epilepsiepatienten als auch im Tiermodell eine Reihe von Veränderungen. Im klassischen Modell der Kainsäure-Injektion (Kainat-Modell) werden die perineuronalen Netze, eine dichte ECM-Struktur um inhibitorische Interneuronen, nach Anfällen strukturell beeinträchtigt. Außerdem werden einige ECM-Komponenten, die für das reife Gehirn charakteristisch sind, herunterreguliert, während ECM-Moleküle, die typischerweise in einem juvenilen Gehirn zu finden sind, hochreguliert werden. Im Kainat-Modell wurde eine Veränderung der synaptischen Dichte von Hippocampus-Neuronen berichtet, die mit dem Abbau des Proteoglykans Brevican einhergeht. Basierend auf früheren Befunden in chemisch induzierten Epilepsiemodellen stellte ich die Hypothese auf, dass sich die Komposition der ECM in der Schwere der Anfälle widerspiegelt, die bei chronischem Status epilepticus beobachtet werden. Ich habe diesen möglichen Zusammenhang in den verschiedenen Linien der Bassoon-Mutanten untersucht. Als Referenz dazu untersuchte ich Veränderungen der ECM in Kainatbehandelten Tieren eine und vier Wochen nach der Injektion. Um den epileptischen Phänotyp der 5 einbezogenen Bassoon-Mutanten zu studieren, wurden Langzeit-EEGs aufgezeichnet und die Gehirne der Tiere für eine anschließende Quantifizierung der ECM-Komponenten entnommen. Mittels semiquantitativer Western- Blot-Analysen, Immunhistochemie und Proteom-Untersuchungen konnte ich zeigen, dass die Mutanten für Bassoon, mit Ausnahme der B2E-Linie, systematisch Anfälle und einen epileptischen Phänotyp bereits im frühen Lebensalter entwickeln, der sich bis ins Erwachsenenalter fortsetzt, wo sie häufiger Anfälle zeigen als die Kainat-Modell-Tiere. Diese Anfälle gehen einher mit Veränderungen in der HA-basierten EZM des Gehirns. Bemerkenswert ist eine starke Abnahme der Brevican-Menge in der Bsn3-Linie, der Linie mit dem stärksten epileptischen Phänotyp. Die B2I-Linie unterscheidet sich von den anderen durch die Erhöhung der Aggrecan-Immunreaktivität, was eher den Veränderungen im Kainat-Modell ähnelt. Insgesamt korreliert bei den Bassoon-Mutanten die Menge an Brevican negativ mit der Häufigkeit der Anfälle, was die Idee eines Zusammenhangs zwischen ECM-Zustand und epileptischem Phänotyp untermauert. Mittels Immunhistochemie an Hirnschnitten untersuchte ich, ob spezifische Modifikationen der EZM im Hippocampus auftreten, einer Region, von der bekannt ist, dass sie vom Epilepsiegeschehen stark betroffen ist. Die EZM-Struktur unterschied sich zwischen Bsn3-Mutanten und Kainat-injizierten Tieren deutlich, wobei der Gyrus dentatus der Bsn3-Mutanten hohe WFA-positive Chondroitinsulfat-Konzentrationen aufwies, während sich das WFA-Signal in der CA1- Region des Hippocampus der Kainat-Tiere anreicherte. Insgesamt liefern die Ergebnisse dieser Arbeit neue Informationen über Veränderungen der HA-basierten EZM bei Epilepsie, sowohl für das Kainat-Modell als auch für ein neues Modell der früh einsetzenden generalisierten Epilepsie: die Bassoon-Mutanten. In den Bassoon-Mutanten könnten die EZM-Veränderungen die Ursache für mehrere zuvor beschriebene Phänotypen sein, wie die Zunahme der Neurogenese oder Modifikationen in der Funktion der Moosfasern. Solche Veränderungen sind vermutlich die Ursache für die Anfälle oder tragen zumindest dazu bei. Somit scheint es möglich, dass die HA-basierte ECM ein therapeutisches Target für die Linderung von Anfällen sein könnte, etwa durch Gegensteuern gegen Zell- oder Netzwerkmodifikationen, die bei Epilepsie auftreten.