Catch me if you can - Identifikation neuer Substrate Mitogen-aktivierter Proteinkinasen (3/6) in Arabidopsis thaliana mittels eines Phosphoproteomics-basierten Ansatzes

Abstract

Substrate Mitogen-aktivierter Proteinkinasen (MAPK) bestehen aus einer Vielzahl von Proteinen, die zelluläre Signalprozesse in Eukaryoten regulieren. In Pflanzen sind bisher nur wenige dieser pflanzlichen, Abwehr-kontrollierenden Substrate bekannt. In dieser Arbeit wurden transgene Arabidopsis thaliana-Pflanzen mit einem induzierbaren System zur Simulation der in vivo-Aktivierung zweier Stress-aktivierter MAPK, MPK3 und MPK6, generiert. Metabolom-Analysen zeigten, dass die künstliche Aktivierung von MPK3/6 ausreicht, um die Produktion von zentralen, Abwehr-relevanten Metaboliten wie Camalexin, indolischer Glucosinolate und Agmatinderivaten zu induzieren. Eine begleitende (Phospho)-proteome-Analyse konnte potentielle Phosphoproteine nach MPK3/6-Aktivierung detektieren. Neben bekannten MAPK-Substraten besitzen viele der Kandidaten typische MAPK-Phosphorylierungsstellen. In vielen Fällen konnten die entsprechenden Phosphopeptide durch Massenspektrometrie detektiert werden. Einige dieser putativen Phosphoproteine werden mit der Biosynthese antimikrobieller Substanzen in Verbindung gebracht (bspw. WRKY Transkriptionsfaktoren, Proteine des “PEN”-Weges).

Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) target a variety of protein substrates to regulate cellular signaling processes in eukaryotes. In plants, the number of identified MAPK substrates that control plant defense responses is still limited. Here, we generated transgenic Arabidopsis thaliana plants with an inducible system to simulate in vivo activation of two stress-activated MAPKs, MPK3 and MPK6. Metabolomics revealed the artificial MPK3/6 activation is sufficient to drive the production of major defense-related metabolites, including various indolic glucosinolates, camalexin and agmatine derivatives. An accompanying (phospho)proteome analysis led to detection of potential phosphoproteins downstream of MPK3/6 activation. Besides known MAPK substrates, many candidates on this list possess typical MAPK-targeted phosphosites and in many cases, the corresponding phosphopeptides were detected by mass spectrometry. Notably, several of these putative phosphoproteins have been reported to be associated with the biosynthesis of antimicrobial defense substances (e.g. WRKY transcription factors, proteins from the “PEN” pathway).