Argininmethyliertes hnRNP K - Synthese und kombinatorische Multidomänen-Nukleinsäure-Assoziation

Abstract

Die biophysikalische Analyse der Argininmethylierung bedarf ausreichender Mengen des modifizierten Proteins. Die Methylierung von heterogenem nukleären Ribonukleoprotein K (hnRNP K) wurde durch Koexpression von protein arginine methyltransferase 1 in E. coli erreicht und ist mit der Methylierung des Säugerproteins identisch. Rekombinantes nicht-methylierte und methyliertes Protein wurde für vergleichende Untersuchungen der Aggregation, Proteininteraktion und RNA-Bindung genutzt. Die beobachtete Aggregation von hnRNP K ist vom Methylierungsstatus unabhängig, reversibel und kann durch hohe Ionenstärken oder Osmolyte verhindert werden. Gleichgewichts-Assoziationen mit repetetiven pyrimidin-reichen DNAs und RNAs wurden mittels Fluoreszenztitrationen untersucht. Die Stöchiometrie eines sequenziellen Bindemechanismus und die einzelnen Dissoziationskonstanten wurden bestimmt. Die Sequenzabhängigkeit der Assoziation deutet darauf hin, dass alle hnRNP K homology (KH)- Domänen von hnRNP K an der Wechselwirkung partizipieren, wobei die erste und zweite KH-Domäne als Tandem-Domäne und die dritte KH-Domäne unabhängig fungieren.

Analysis of arginine methylation requires access to methylated protein for biophysical and biochemical analyses. Methylation of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K (hnRNP K) upon co-expression with protein arginine methyltransferase 1 in E. coli was found to be identical to the modification of hnRNP K from mammalian cells. Recombinant non-methylated and arginine-methylated hnRNP K was used to characterize self-aggregation, protein-protein interaction and nucleic acid binding. Reversible self-aggregation is independent of hnRNP Ks methylation but can be prevented by high ionic strength and specific osmolytes. Steady state association of hnRNP K with pyrimidine repeat-containing RNA and DNA was analyzed by fluorescence titration. The stoichiometry of a sequencial binding mechanism and the individual affinity constants were determined. Sequence dependence of association, measured by steady state competition assay, indicate that all hnRNP K homology (KH) domains of hnRNP K contribute differentially to RNA binding, with KH1-KH2 acting as a tandem domain and KH3 as an individual binding domain.