Regulation of synaptic signaling following environmental enrichment and local secretory trafficking in neuronal dendrites

Abstract

A hallmark of the brain is its plasticity. To achieve this, the brain must be able to react to internal and external stimuli, either by changing or modifying molecular components of its neural cells or by altering connections between neurons. In the first part of this thesis a novel proteomics and lipidomics approach is used to analyze the protein and lipid composition of murine synapses. The second part of my thesis deals with the question how some of these synaptic proteins are processed and transported locally in dendrites. In fact, membrane lipids are important components of synaptic junctions. Compelling evidence suggests their participation in fundamental processes of synaptic neurotransmission. However, our knowledge about the lipid composition of synaptic membranes is still sparse. The protein and lipid content of synapses can be analyzed using mass spectrometry. The combination of both proteomics and lipidomics in a multiomics approach allows for the generation of novel hypotheses, which could not be achieved by applying only one of the techniques. In this study this approach is tested by applying it to a well-established mild stimulation protocol. To do this, mice were raised in an enriched environment (EE) with toys, housing, and social interactions. It is well known that this intervention results in improved physical and mental performance, while the molecular changes in the synapse which accompany these changes are poorly understood. A multiomics approach revealed a regulation of synaptic endocannabinoid signaling on both protein and lipid level following exposure to EE. Mice raised in EE showed a significant reduction of the synaptic levels of the signaling lipid 2-Arachidonoylglycerol (2-AG), which is the main agonist of the Cannabinoid receptor 1 (CB1R) in the hippocampus. A parallel proteomics approach revealed a regulation of two postsynaptic enzymes involved in endocannabinoid signaling. Fatty acid amide hydrolase (FAAH), an enzyme responsible for the degradation of 2-AG and N-arachidonoylethanolamine (AEA), was significantly upregulated following EE. In contrast alpha/beta-Hydrolase domain containing 6 (ABHD6) a second enzyme responsible for the degradation of 2-AG was significantly downregulated. Based on further experimental work I propose that alterations in the postsynaptic association of ABHD6 and FAAH (catabolizing enzymes of 2-AG exclusively expressed in 30% of excitatory CA1/CA3 synapses) interact with lowered levels of 2-AG to facilitate endocannabinoid signaling (ECS)-sensitive forms of plasticity at a subset of CA1-CA3 synapses in EE. In brief, lower postsynaptic 2-AG levels appear to negatively influence the postsynaptic localization of ABHD6. This in turn increases surface expression of AMPARs following LTP induction as ABHD6 is an auxiliary subunit of AMPARs that negatively regulates surface expression. The increased synaptic activity will elevate postsynaptic FAAH levels and decrease 2-AG. Lower 2-AG levels will reduce CB1R signaling and the postsynaptic expression of ABHD6. These changes will only affect a subset of CB1R positive synapses in the Schaffer collateral pathway and will lower the threshold for the induction of certain forms of plasticity (metaplasticity). Many proteins involved in this pathway are synaptic transmembrane proteins, which have to undergo a complex series of quality controls and modifications following their exit from the endoplasmic reticulum (ER). This process exists in all eukaryotic cells, but is especially challenging for neurons, since they are highly arborized and polarized cells. The soma makes up only 5% of the total cell volume and only 1% of membrane proteins are localized to the somatic cell membrane. This morphological complexity poses a major challenge for neurons since they need to process and modify proteins far from the soma, in dendrites and axons which harbor up to 10000 synapses. Synaptic receptors such as AMPARs and NMDARs, as well as cell adhesion molecules that connect pre- and postsynapse undergo a complex series of quality controls and modification following their synthesis in the ER. The ER is continuous throughout the dendrites and many components of the secretory system, such as ERGIC and Retromer are abundant in dendrites. Mature glycosylation of surface proteins requires transport through Golgi membranes. The Golgi apparatus is located in the soma, while glycosylation machinery-containing Golgi satellites are present throughout the dendritic arbor. This ubiquitous distribution sets them apart from Golgi outposts, which are only found in a subset of primary apical dendrites. Calneuron 1 which is localized in Golgi satellites and the TGN and regulates the export of membranes from the Golgi in a calcium dependent manner. The number of Golgi satellites is reduced following Calneuron 1 KO. Loss of Calneurons also resulted in a loss of synapses predominantly in distal dendrites, suggesting a crucial role for Calneurons in these distal dendrites. This result points to an important role for Calneurons in stabilization and maintenance of Golgi satellites. Lectin stainings demonstrate that Golgi satellites contain O- and N- glycosylated proteins. A specific glycosylation, with a crucial function in synaptic plasticity, is the polysialylation of the cell adhesion molecule NCAM. Golgi satellites contain PSA-NCAM as well as the enzyme that catalyzes the polysialylation. Loss of Calneuron 1 results in loss of PSA-NCAM in distal dendrites. This confirms the importance of Calneuron 1 for the function of Golgi satellites and suggests an important role for Golgi satellites in synaptic plasticity relevant glycosylation in dendrites.

Membranlipide sind wichtige Komponenten der synaptischen Membran. Überzeugende Hinweise legen nahe, dass sie eine fundamentale Rolle in der synaptischen Neurotransmission spielen. Allerdings ist das Wissen über die Lipidzusammensetzung der synaptischen Membran immer noch begrenzt. Die Protein- und Lipidzusammensetzung kann mit Hilfe von Massenspektrometrie untersucht werden. Die Kombination von Lipidomik und Proteomik in einem Multiomicsansatz, ermöglicht es neue Hypothesen zu generieren, die nicht durch die Verwendung nur einer der Methoden hätten erreicht werden können. Hierzu wurden Mäuse in einem sogenannten enriched environment (EE) mit Spielzeug, Versteckmöglichkeiten und sozialen Interaktionen gehalten. Es ist bekannt, dass diese Intervention in einer gesteigerten körperlichen und mentalen Leistungsfähigkeit resultiert, die damit einhergehenden molekularen Änderungen der Synapse sind nicht ausreichend geklärt. Der in dieser Arbeit verwendete Multiomicsansatz offenbarte eine Regulation der synaptischen Endocannabinoid-abhängigen Signalweiterleitung sowohl auf Protein- als auch auf Lipidebene infolge von EE. Die Mäuse zeigen eine signifikante Reduktion der synaptischen Konzentration des Signallipids 2-Arachidonoylglycerol (2-AG), wobei es sich um den Hauptagonisten des Cannabinoid-Rezeptors 1 (CB1R) im Hippocampus handelt. Ein paralleler Proteomikansatz offenbarte die Regulation zweier postsynaptischer Enzyme die an der Regulation der endocannabinoidabhängigen Signalweiterleitung beteiligt sind. FAAH ein Enzym, das sowohl für die Degradation von 2-AG als auch AEA verantwortlich ist, ist in Folge von EE deutlich hochreguliert. Im Gegensatz dazu war die synaptische Konzentration von ABHD6 in Folge von EE herunterreguliert. Basierend auf weiteren Versuchen schlage ich vor, dass die Assoziation von ABHD6 und FAAH (katabolische Enzyme von 2-AG, die in 30% der exzitatorischen CA1-CA3 Synapsen exprimiert werden) mit der Postsynapse mit verringerten Konzentrationen von 2-AG interagiert, was in Folge von EE zu einer Endocannabinoid-Signalübertragung (ECS)-sensitiven Form von Plastizität in einer Untergruppe von CA1-CA3 Synapsen führt. Kurz gesagt, geringere postsynaptische 2-AG Konzentrationen scheinen die postsynaptische Lokalisation von ABHD6 negativ zu beeinflussen. Dies wiederum führt zu einer verstärkten Oberflächenexpression von AMPARs infolge von LTP, da ABHD6 eine auxilare Untereinheit von AMPARs ist, die deren Oberflächenexpression negativ beeinflusst. Der Anstieg in synaptischer Aktivität erhöht postsynaptische FAAH Level und reduziert damit die Konzentration von 2-AG. Reduzierte 2-AG Level reduzieren die Signalweiterleitung durch CB1R und die postsynaptische Expression von ABHD6. Diese Änderungen betreffen nur eine Untergruppe von CB1R positiven Synapsen in der Schaffer-Kollaterale und reduzieren die Schwelle für die Induktion bestimmter Formen der Plastizität (Metaplastizität). Bei vielen Proteinen, die an diesem Prozess beteiligt sind, handelt es sich um synaptische Transmembranproteine, die eine komplexe Abfolge von Qualitätskontrollen und Modifikationen unterlaufen müssen, nachdem sie aus dem Endoplasmatische Retikulum (ER) exportiert wurden. Dieser Prozess existiert in allen eukaryotischen Zellen, stellt aber eine besondere Herausforderung für Neurone dar, da es sich bei ihnen um stark arborisierte und polarisierte Zellen handelt. Das Soma macht nur 5% des gesamten Zellvolumens aus und nur 1% der Membranproteine befinden sich in somatischen Zellmembranen. Diese morphologische Komplexität stellt Neurone vor eine große Herausforderung, da sie Proteine in großer Entfernung zum Soma in Dendriten und Axonen modifizieren müssen, auf denen sich bis zu 10000 Synapsen befinden. Synaptische Rezeptoren, wie AMPARs und NMDARs, sowie Zelladhäsionsmoleküle, die Prä- und Postsynapsen verbinden, müssen nach ihrer Synthese im ER eine komplexe Reihe von Qualitätskontrollen und Modifikationen durchlaufen. Das ER ist durchgehend in den Dendriten verbreitet, wichtige Komponenten des sekretorischen Systems, wie ERGIC und Retromer sind ebenfalls weit verbreitet. Diese ubiquitäre Verteilung unterscheidet sie von Golgi-Außenposten, die nur in einer Untergruppe von primären apikalen Dendriten zu finden sind. Calneuron 1 lokalisiert zu Golgisatelliten und dem TGN und reguliert den Export von Vesikeln aus dem trans-Golgi-Netzwerk in Abhängigkeit von der freien Calciumkonzentration. Die Anzahl von Golgisatelliten ist in den Dendriten von Calneuron 1 Knockout Mäusen reduziert. Der Verlust von Calneuron führte zu einem Verlust von Synapsen, vor allem in distalen Dendriten. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass Calneuron 1 eine wichtige Rolle für den Membrantransport und die Strukturerhaltung von Golgisatelliten spielt. Lectin-Färbungen zeigen, dass Golgisatelliten O-, N- und Core-glykosylierte Proteine enthalten. Eine spezifische Glykosylierung, mit einer entscheidenden Funktion für synaptischer Plastizität ist die Polysialylierung des Zelladhäsionsmoleküls NCAM. Golgisatelliten enthalten PSA-NCAM sowie mindestens ein Enzym, dass die Polysialylation katalysiert. Verlust von Calneuron 1 führt zum Verlust von PSA-NCAM in distalen Dendriten. Dies bestätigt die Bedeutung von Calneuron 1 für die Funktion von Golgisatelliten und lässt vermuten, dass sie eine Rolle für plastizitätsrelevante Glykosylierung in Dendriten spielen.