Application of computer-based methods to analyze NAD+-dependent enzymes

Abstract

Die hier vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit drei ausgewählten NAD-abhängigen Transferasen, welche aus struktureller und biochemischer Sicht noch nicht ausreichend charakterisiert sind. Das bakterielle Toxin CDT, sowie die humanen Sirtuine Sirt4 und Sirt5 wurden mittels computergestützter Methoden genauer untersucht, um Modelle bezüglich struktureller Eigenschaften sowie Protein-Ligand Wechselwirkungen abzuleiten. Mögliche Konformationen von CDT und Sirt5 wurden mittels Moleküldynamik-Simulationen näher untersucht, wobei eine signifikante strukturelle Variabilität innerhalb der NAD- und Substratbindungstaschen festgestellt wurde. Weiterhin wurden konservierte Wassermoleküle, welche bedeutsam für die Proteinstuktur und Protein-Ligand-Wechselwirkungen sind, anhand von Stukturvergleichen und Anwendung aktueller, theoretischer Ansätze gefunden. Die gewonnenen Erkenntnisse und Modelle waren hilfreich, um konsistente Bindungshypothesen aufzustellen und wurden in verschiedenen virtuellen Screenings berücksichtigt. Im Rahmen der durchgeführten computergestützten Experimente wurden verschiedene neuartige Hemmstoffe vorgeschlagen, wobei für 11 Verbindungen eine Hemmung von CDT, sowie für mehr als 10 Verbindungen eine Hemmung von Sirt5 anhand anschliessender in-vitro Tests gezeigt werden konnte. Da für Sirt4 zum Zeitpunkt der Arbeit keine Kristallstruktur existierte, wurde ein Homologiemodell ausgehend von verwandten Proteinstrukturen entwickelt. Mögliche Substrate wurden mittels molekularem Docking hinsichtlich Kompatibilität überprüft und eine Reihe diverser Verbindungen wurde durch strukturbasiertes virtuellen Screening als Hemmstoffe vorgeschlagen.

Three less characterized enzymes, namely CDT, Sirt4 and Sirt5, were computationally analyzed in this work, in order to gain further insights into their structural properties and to predict small-molecule inhibitors of their enzymatic activity. The conformational space of CDT and Sirt5 was analyzed by means of enhanced sampling techniques and a significant flexibility was observed for critical components forming the \NAD and substrate binding sites. Representative conformation were extracted from the simulation trajectories and incorporated into the design process of protein-ligand binding models. Conserved and likely important waters were found by crystal structure comparison and confirmed by applying the three-dimensional reference interaction site model theory. Knowledge and models gained from these computationally studies were incorporated into several structure-based virtual screening campaigns, which lead to the identification of 11 novel inhibitors of CDT and more than 10 compounds which were able to inhibit Sirt5 activity in in-vitro assays. Due to a lack of a Sirt4 crystal structures, a homology model was developed for this enzyme and putative substrates were suggested by means of docking methods. In order to proceed with the biochemical characterization of this novel target protein, a large-scale virtual screening was carried out and a number of diverse compounds was predicted as putative Sirt4 inhibitors.