Generierung künstlicher Bindeproteine basierend auf dem humanen γB-Kristallin

Abstract

Das Zwei-Domänen-Protein humanes gamma B-Kristallin ist bereits als alternatives Bindeprotein etabliert, wobei auf dem äußeren β-Faltblatt der N-terminalen Domäne ein de novo-Paratop geschaffen wurde. In dieser Arbeit wurde hingegen ein alternatives Paratop mit bis zu 13 randomisierten Aminosäurepositionen in der Interdomänen-Kontaktfläche des Proteins generiert. Als Zielstruktur für Selektionen im TAT-abhängigen Phagen-display diente der Tumornekrosefaktor (TNF)-alpha. Mit diesem Konzept war die Generierung einer hochfunktionalen Bibliothek möglich die letztlich zur Isolierung der TNF α-bindenden Variante R3-B11 führte. Die 13 Substitutionen nahmen deutlichen Einfluss auf Struktur und thermische Stabilität von R3-B11. Die Affinität zum target lag im niedrigen nanomolaren Bereich, wobei die Interaktion auf einer 1:1 Stöchiometrie bezüglich des TNF α-Monomers beruhte. Das Epitop wird innerhalb der Monomer-Kontaktfläche vermutet, da die Bindung der Kristallin-Variante mit der Dissoziation des TNF α-Homotrimers einherging.

The all-β-sheet two domain protein human γB crystallin was already established as a scaffold to create artificial binding proteins. The crystallin has been engineered with randomized, solvent-exposed amino acids on the outer beta sheet of the N-terminal domain to generate a de novo paratope. For further development of this concept an alternative paratope was generated in the interdomain contact area of the protein. For this purpose library formats with up to 13 randomized amino acid positions were constructed. The protein tumor necrosis factor (TNF)-alpha was chosen as target structure for the selection process in TAT-dependent phage display. With this concept the generation of a highly functional library was possible which finally led to the isolation of the TNF α binding variant R3-B11. The 13 substitutions revealed distinct influence on structure and thermal stability of the binder. The target affinity was in the low nanomolar range with a 1:1 stoichiometry referring to the TNF α monomer. The epitope is presumed within the contact area of the monomers because the crystallin variant can only bind after dissociation of the TNF α trimer.