Biochemische Charakterisierung und Identifizierung neuer Inhibitoren der humanen Myt1-Kinase

Abstract

Als ein Mitglied der Wee-Kinasefamilie ist die Myt1-Kinase bei der Regulation des G2/M Checkpoints im Zellzyklus beteiligt. Zu Beginn dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines Microarrays das kurzkettige Peptid EFS247-259 als Myt1-Substrat identifiziert, welches die Entwicklung eines fluoreszenzpolarisationsbasiertem Aktivitätsassys ermöglichte. Während der Entwicklung wurde der Einfluss von verschiedenen externen Faktoren untersucht und die Myt1 vermittelte Phosphorylierung von EFS247-259 charakterisiert. Zum erstem Mal konnten die kinetischen Parameter Km, Km, ATP und vmax bestimmt werden. Außerdem wurden 932 Verbindungen aus verschiedenen Datenbaken und dem PKIS I und II, welches ATP-kompetitive Kinaseinhibitoren beinhaltet, an der Myt1 getestet. So konnten zehn neue Myt1-Inhibitoren identifiziert werden, die drei neue Grundgerüste aufweisen und die erste Definition von Struktur-Wirkungsbeziehungen ermöglichten. Die erhaltenen Ergebnisse liefern die Basis für zukünftige Untersuchungen von molekularen Mechanismen der Myt1-Kinase, der Charakterisierung von neuen Inhibitoren und der Optimierung von Leitstrukturen.

As a member of the Wee-kinase family Myt1 kinase is involved in G2/M checkpoint regulation of the cell cycle. Recently, a peptide microarray approach led to the identification of a short-chain peptide EFS247-259 as substrate of Myt1 kinase, which allowed for subsequent development of an fluorescence polarization based activity assay. The developed Myt1 activity assay was used to investigate the influence of external factors and to characterize the Myt1 catalyzed phosphorylation of EFS247-259. For the first time the kinetic parameters Km, Km, ATP and vmax were determined. Additionally 932 compounds from different databases and the published protein kinase inhibitor sets (PKIS I and II), a set of small molecule ATP-competitive kinase inhibitors, were screened. So ten new Myt1 inhibitors were identified, providing three new scaffolds and allowed the first definition of structure-activity relationships for Myt1 inhibitors. The derived results provide the basis for further investigating the molecular mechanism of Myt1, the characterization of new enzyme inhibitors and lead structure optimization.