Untersuchungen zur rekombinanten Proteinexpression im Chloroplasten von Chlamydomonas reinhardtii

Abstract

Für die heterologe Genexpression stellt der Chloroplast von C. reinhardtii eine aussichtsreiche Alternative zu klassischen Expressionssystemen dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein effizientes und universell verwendbares System zur Erzeugung transgener Algenstämme etabliert, das auf dem Vektor pMM2 und dem nur heterotroph wachsenden Rezipientenstamm Fud7 basiert. Die spezielle MCS von pMM2 ermöglicht den Einbau individueller, aus PCR-Fragmenten zusammengesetzter Transgene innerhalb nur eines Reaktionsansatzes. Ferner sind Transformanten in der Lage photoautotroph zu wachsen und können ohne den Gebrauch von Antibiotika auf Minimalmedium im Licht selektiert werden. Mit den Versuchen die Proteine MPT64, eGFP, PF4, PCS und BKT im Chloroplasten von C. reinhardtii zu synthetisieren, ist es gelungen die bisher höchste Fremdproteinakkumulation in photosynthetisch aktiven Algenzellen zu detektieren (Mutante 16S/HMPT), einen starken Doppelpromotor (7S16S) zu etablieren und das Thylakoidlumen als potentiell geeigneten Akkumulationsort für Fremdproteine zu identifizieren.

For the heterologous gene expression the chloroplast of C. reinhardtii is a promising option in comparison to typical expression systems. During this work an efficient and universally usable system for generating transgenic algae strains was established, which based on the vector pMM2 and the only heterotrophic growing recipient strain Fud7. The special MCS of pMM2 allows in just one reaction step the integration of individual transgenes consisting of assembled PCR-fragments. Transformants are able to grow photoautotrophically and can be selected on minimal media in the light without using antibiotics. By testing the synthesis of the proteins MPT64, eGFP, PF4, PCS and BKT in the chloroplast of C. reinhardtii the highest foreign protein accumulation in photosynthetic algae cells (mutant 16S/HMPT) till now could be detected. Furthermore a strong double promoter (7S16S) was established and the thylakoid lumen was identified as a potentially useful accumulation place for foreign proteins.