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Titel: Development of chromatography-based purification processes for cell culture-derived influenza virus particles
Autor(en): Weigel, Thomas
Gutachter: Reichl, UdoIn der Gemeinsamen Normdatei der DNB nachschlagen
Körperschaft: Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg, Fakultät für Verfahrens- und Systemtechnik
Erscheinungsdatum: 2022
Umfang: XXII, 145 Seiten
Typ: HochschulschriftIn der Gemeinsamen Normdatei der DNB nachschlagen
Art: Dissertation
Tag der Verteidigung: 2021
Sprache: Englisch
URN: urn:nbn:de:gbv:ma9:1-1981185920-882359
Schlagwörter: Chromatographische Analyse
Elektrophorese
Influenza-Viruspartikel
Aufreinigungsprozess
Zusammenfassung: The possibility to establish a chromatographic purification process for cell culture-derived influenza virus (IV) particles in the context of an influenza vaccine manufacturing process was tested here. The purification process was required to be as simple as possible but capable of achieving the required deoxyribonucleic acid (DNA) and protein contamination limits according to the European Pharmacopeia. In total, three different purification processes were designed and tested, which were placed after the steps clarification and concentration at the beginning of the downstream process chain. Special focus was put on high virus yields in each step as well as on the depletion of DNA, the latter posing a significant challenge for most published processes, so far. In addition, IV strain dependency of the complete process or the process steps was tested using three different cell culture-derived IV strains (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 (A/PR); A/Wisconsin/67/2005, H3N2 (A/Wis) and B/Malaysia/2506/2004 (B/Mal)). Furthermore, all three processes were tested for compliance with the requested limits of the European Pharmacopeia for cell culture-derived vaccines for human use. The first process was designed as a completly flow-through based process in order to address the annual adaptation of multivalent influenza vaccines and emergence of new serotypes such as the bird flu H5N1. It avoids any virus-specific capture steps and reduces the requirement of specific elution buffers that potentially could have a negative impact on immunogenicity. At first, different anion-exchange chromatography (AEC) materials (strong and weak AEC) were tested regarding virus yields and DNA depletion. High virus yields (98–101% (of the column loaded virus material)) with DNA contents as low as 1.2% were achieved for the strong AEC. Additionally, a modern size-exclusion chromatography resin type with a ligand-activated core (ligand-activated core chromatography (LCC); Capto™ Core 700) was tested giving high virus yields of up to 94% and a residual total protein content as low as 37%. Furthermore, for a nuclease step the optimal concentration and the reaction endpoint were determined with 50 U/mL and about 13 h, respectively. Afterwards, a three-step process was established relying on the established AEC step, the nuclease step, and the LCC step. The complete process was tested with all three IV strains. It resulted in virus yields ≥68% with protein contamination levels fulfilling requirements of the European Pharmacopeia. DNA was depleted by ≥98.7% for all strains. The measured DNA concentrations per dose were close to the required limits of 10 ng DNA per dose set by the European Pharmacopeia. In subsequent experiments, detrimental effects of an added antibiotic as well as a suboptimal single radial immunodiffusion (SRID) assay protocol causing an apparent virus yield decrease were found. The re-evaluation of the process data led to an estimated virus yield of ≥81% with a DNA content as low as 2.5–4.6 ng DNA per monovalent dose, which for two of the three tested IV strains complies with the limits of the European Pharmacopeia. In addition, it was shown that the added nuclease could be successfully removed by LCC from the product fraction. The second process was set up as a completely membrane-based process in order to make full use of the high binding capacities, flow rates and productivities of membrane-based processes. In this context, a salt-tolerant membrane adsorber (STMA) was tested. As a starting point, a dual-salt strategy (with two polyvalent ions) was applied in a 96-well format screening for suitable STMA purification process conditions. After optimization at laboratory scale, a virus yield of up to 97% with a residual DNA level below 0.82% was achieved. In addition, the STMA was characterized regarding its dynamic binding capacity and the impact of flow rate on yields and contamination levels. Following, a process was established relying on only two unit operations. A pseudo-affinity membrane adsorber (sulfated cellulose; sulfated cellulose membranes adsorber (SCMA)) was applied for virus capture in a first chromatography step. The subsequent polishing step consisted of the STMA to bind residual DNA. For this presented process neither a buffer exchange step nor a nuclease step for further DNA digestion was required. Overall, the total virus yield for the tested influenza virus strain (A/PR) of this two-step membrane process was 75%, while the protein and the DNA contamination level could be reduced to 24% and at least to 0.5%, respectively. With 19.8 μg protein and 1.2 ng DNA per monovalent dose, this purity level complies with the limits of the European Pharmacopeia. The third process was designed as an orthogonal process utilizing vastly different separation principles in order to achieve a high purity as well as a high adaptability of the process. At first, options for hydrophobic-interaction chromatography (HIC) for purification of influenza virus particles have been assessed using a 96-well-plate format in a semi-high-throughput approach. After optimization at laboratory scale, virus yields of up to 96% with a residual DNA level of about 1.3% were achieved. Based on this, a process relying on only two unit operations could be established. In a first process step, an AEC (using strong quaternary ammonium ligands) was applied for binding the DNA. Subsequently, HIC (with polypropylene glycol as functional group) was used to reversibly bind virus particles for capture and to remove residual contaminating DNA and proteins (flow-through). This two-step chromatographic process, which requires neither a buffer exchange step nor a nuclease step, resulted in a total virus particle yield for IV A/PR of 92%. The protein and the DNA contamination level could be reduced to 42% and at least to 1.0%, respectively. With 17.2 μg total protein and 2.0 ng DNA per monovalent dose, this purity level complies with the limits of the European Pharmacopeia. Overall, it could be shown for all three presented downstream processes that the required purity levels according to the European Pharmacopeia were achievable, while resulting in high virus yields. Therefore, they represent valuable alternatives to existing IV purification process schemes. Furthermore, the three processes only utilize off-the-shelf materials and represent simple as well as economic processes for IV particle purification. In particular, the flow-through process has the potential to serve as a simple, generic and economic platform technology for production of other cell culture-derived viruses and viral vectors.
In dieser Arbeit wurde die Möglichkeit der Entwicklung eines chromatographischen Aufreinigungsprozesses für zellkulturbasierte Influenza-Viruspartikel im Rahmen eines Influenza-Impfstoff-Herstellungsprozesses untersucht. Der Aufreinigungsprozess sollte dabei so einfach wie möglich aber auch im Stande sein, die erforderlichen DNA- und Protein-Verunreinigungsgrenzwerte entsprechend dem Europäischen Arzneibuch zu erreichen. Insgesamt wurden drei Aufreinigungsprozesse entwickelt und getestet, welche innerhalb der Produktaufarbeitungsprozesskette nach der Klärung und Konzentrierung lokalisiert sind. Besonderes Augenmerk wurde auf hohe Virusausbeuten in jedem Schritt als auch auf die Abreicherung der DNA gelegt, da Letzteres eine große Herausforderung für die meisten bislang publizierten Prozesse dargestellt hat. Darüber hinaus wurde die Influenza-Virusstamm-Abhängigkeit des gesamten Prozesses bzw. der Prozessschritte anhand von drei verschiedenen zellkulturbasierenden Virusstämmen (A/PR; A/Wis und B/Mal) überprüft. Auch wurden alle drei Prozesse bezüglich der Einhaltung der geforderten Grenzwerte des Europäischen Arzneibuches für zellkulturbasierte Impfstoffe zur humanen Verwendung geprüft. Der erste Prozess war als ein vollständig durchflussbasierter Prozess konzipiert, um der jährlichen Anpassung von multivalenten Influenza-Impfstoffen und dem Auftreten neuer Serotypen wie der Vogelgrippe H5N1 Rechnung zu tragen. Er vermeidet jegliche virusspezifischen Anbindungsschritte und macht die Verwendung spezifischer Elutionspuffer obsolet, welche einen potenziellen negativen Effekt auf die Immunogenizität haben könnten. Zunächst wurden verschiedene Anionenaustauscher (AEC) Materialien (starke und schwache AEC) hinsichtlich der Virusausbeute und der DNA Abreicherung getestet. Mit dem starken Anionenaustauscher wurden hohe Virusausbeuten (98–101 % (des auf die Säule geladenen Virusmaterials)) mit DNA-Gehalten von bis zu 1,2 % erzielt. Darüber hinaus wurde ein moderner Größenausschluss-Chromatographie-Materialtyp mit einem liganden-aktivierten Kern (Liganden-aktivierter-Kern-Chromatographie (LCC); Capto™ Core 700) getestet. Er ergab hohe Virusausbeuten von bis zu 94 % und einen Restgesamtproteingehalt von bis zu 37 %. Des Weiteren wurden für einen Nuklease-Schritt die optimale Konzentration und der Reaktionsendpunkt mit 50 U/ml bzw. etwa 13 h ermittelt. Anschließend wurde ein dreischrittiger Prozess basierend auf dem etablierten AEC-, Nuklease- und LCC-Schritt aufgestellt. Der vollständige Prozess wurde jeweils mit allen drei Influenza-Virusstämmen getestet. Er lieferte Virusausbeuten ≥68 % zusammen mit Proteinverunreinigungswerten, welche die Anforderungen des Europäischen Arzneibuches erfüllten. Die DNA wurde für alle Virusstämme um ≥98,7 % abgereichert. Die gemessene DNA-Konzentration pro Dosis lag nahe an dem vom Europäischen Arzneibuch geforderten Grenzwert von 10 ng DNA pro Dosis. In nachfolgenden Experimenten konnten sich nachteilig auswirkende Effekte des zugesetzten Antibiotikums als auch eines suboptimalen SRID Nachweisverfahrensprotokolls nachgewiesen werden, die zu einer scheinbaren Verringerung der Virusausbeute geführt hatten. Eine erneute Evaluierung der Prozessdaten führte zu einer geschätzten Virusausbeute von ≥81 % mit einen DNA-Gehalt von bis zu ≥2,5 ng DNA pro monovalenter Dosis, was für zwei der drei getesteten Stämme die Grenzwerte des Europäischen Arzneibuches erfüllte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die zugesetzte Nuklease erfolgreich durch die LCC aus der Produktfraktion entfernt werden konnte. Der zweite Prozess war als vollständig membranbasierter Prozess ausgelegt, um die hohen Bindungskapazitäten, Flussraten und Produktivitäten von membranbasierten Verfahren im vollen Umfang auszunutzen. In diesem Zusammenhang wurde ein salztoleranter Membranadsorber (STMA) eingesetzt. Als Ausgangspunkt wurde eine duale Salzstrategie (mit zwei polyvalenten Ionen) in einem 96-Well-Screeningformat im Hinblick auf geeignete STMA Prozess-/Aufreinigungsbedingungen getestet. Nach Optimierung im Labormaßstab wurden eine Virusausbeute von bis zu 97 % und ein DNA-Restgehalt von unter 0,82 % erreicht. Darüber hinaus wurde der STMA hinsichtlich seiner dynamischen Bindungskapazität und dem Einfluss der Flussrate auf die Virusausbeute und den Verunreinigungsgehalt charakterisiert. Anschließend wurde ein Prozess etabliert, welcher lediglich aus zwei Operationseinheiten bestand. Ein Pseudoaffinitäts-Membranadsorber (sulfatisierte Zellulose; Sulfatisierte-Zellulose-Membranadsorber (SCMA)) diente zur Viruspartikelanbindung in einem ersten Chromatographieschritt. Der nachfolgende Feinreinigungsschritt bestand aus dem STMA zur Anbindung der restlichen DNA. Für diesen Prozess waren weder ein Pufferaustauschzwischenschritt noch ein Nuklease-Schritt zwecks weiteren DNA-Verdaus erforderlich. Insgesamt betrug die Virusgesamtausbeute beim getesteten Influenza-Virusstamm (A/PR) für den Zwei-Schritt-Membranprozess 75 %, während die Protein- und DNA-Verunreinigung auf 24 % bzw. mindestens 0,5 % reduziert werden konnte. Mit 19,8 μg Protein und 1,2 ng DNA pro monovalente Dosis erfüllt der Reinheitsgrad die Grenzwerte des Europäischen Arzneibuches. Der dritte Prozess war als orthogonaler Prozess konzipiert, bei dem gänzlich unterschiedliche Aufreinigungsprinzipien zum Einsatz kamen, um eine hohe Reinheit und eine hohe Anpassungsfähigkeit des Prozesses zu erreichen. Zunächst wurden verschiedene Optionen der Hydrophoben-Interaktions-Chromatographie (HIC) zur Aufreinigung von Influenza-Viruspartikeln mittels eines 96-Well-Platten-Formats in einem Semi-Hochdurchsatz-Ansatz untersucht. Nach Optimierung im Labormaßstab wurden Virusausbeuten von bis zu 96 % mit einem Rest-DNA-Gehalt von ungefähr 1,3 % erzielt. Basierend darauf konnte ein Prozess bestehend aus lediglich zwei Operationseinheiten etabliert werden. Im ersten Prozessschritt wurde ein Anionenaustauscher (mit starken quartären Ammonium-Liganden) zur DNA-Anbindung eingesetzt. Darauf folgend wurde die HIC (mit Polypropylenglykol als funktionelle Gruppe) zur reversiblen Viruspartikelanbindung und zur Entfernung der restlichen verunreinigenden DNA und Proteine (Durchfluss) verwendet. Dieser Zwei-Schritt-Chromatographie-Prozess, welcher weder einen Pufferaustausch- noch einen Nuklease-Schritt benötigt, erzielte für das Influenza-Virus A/PR eine Viruspartikelausbeute von 92 %. Der Protein- und DNA-Verunreinigungsgrad konnte auf 42 % bzw. mindestens 1,0 % reduziert werden. Mit 17,2 μg Gesamtproteingehalt und 2,0 ng DNA-Gehalt pro monovalenter Dosis erfüllt der Reinheitsgrad die Grenzwerte des Europäischen Arzneibuches. Insgesamt konnte für alle drei vorgestellten Aufreinigungsprozesse gezeigt werden, dass die erforderlichen Reinheiten gemäß dem Europäischen Arzneibuch zusammen mit hohen Virusausbeuten erreichbar sind. Somit bilden sie wertvolle Alternativen zu bestehenden Influenza-Virus-Aufreinigungsprozess-Entwürfen. Des Weiteren verwenden alle drei Prozesse ausschließlich marktverfügbare Materialien und stellen sowohl einfache als auch ökonomische Prozesse zur Influenza-Viruspartikel-Aufreinigung dar. Insbesondere besitzt der Durchflussprozess das Potenzial, als einfache, generische und ökonomische Plattformtechnologie zur Produktion von anderen zellkulturbasierten Viren und viralen Vektoren zu fungieren.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/88235
http://dx.doi.org/10.25673/86282
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Enthalten in den Sammlungen:Fakultät für Verfahrens- und Systemtechnik

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