Cryo-electron microscopy studies of native cell extracts : elucidating an active pyruvate dehydrogenase complex from Chaetomium thermophilum

Abstract

An der oxidativen Decarboxylierung von Pyruvat ist einer der kritischsten und wichtigsten Komplexe beteiligt, der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHc) Enzymverbund. PDHc besteht aus drei Kernkomplexen. Aufgrund seiner Heterogenität, Größe und Plastizität wurde die quaternäre Struktur von PDHc bisher noch nie im Detail untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurden vollständig aufgebaute C. thermophilum α-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexe in nativen Zellextrakten identifiziert. Ihre Domänenanordnungen wurden mit Hilfe von Proteomik, Aktivitätsuntersuchungen, Vernetzung, Elektronenmikroskopie und Computermodellierung charakterisiert. Es wurde eine Kryo-EM-Struktur des PDHc-Kerns veröffentlicht. Neben der Visualisierung von Faltung und Bindungsvorgängen wurde eine asymmetrische Rekonstruktion einer 10-MDa-PDHc dargestellt. Die Nähe der Komponenten wurde zusammen mit den vorgeschlagenen stöchiometrischen Daten sowie einem minimalen Reaktionsweg zwischen den Komponentenenzymen beschrieben.

The oxidative decarboxylation of pyruvate involves one of the most critical and key playing complexes, the enzymatic assembly known as Pyruvate Dehydrogenase Complex (PDHc). PDHc consists of three core components E1, E2/E3BP and E3 in multiple copies. Due to its heterogeneity, relatively enormous size and plasticity, the quaternary structure of PDHc has never been addressed in detail before. In the current work, fully assembled Chaetomium thermophilum α-keto acid dehydrogenase complexes in native cell extracts were identified. Their domain arrangements were characterised utilising proteomics, activity assays, crosslinking, electron microscopy and computational modelling. A cryo-EM structure of the PDHc core was reported. Besides visualised folding and binding events an asymmetric reconstruction of a 10-MDa PDHc was illustrated. The spatial proximity of its components was described and along with the proposed stoichiometric data, suggested a minimum reaction path among component enzymes.