Die Phosphorylierung von Plakophilin3 durch die p70-S6-Kinase und ihr Einfluss auf Funktion und Lokalisation

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob eine Interaktion zwischen Plakophilin3 und der p70-S6-Kinase stattfindet und mögliche Auswirkungen auf die Funktion von Plakophilin3 zu untersuchen. Eine Interaktion wurde in vitro und in der Zelle nachgewiesen. Mittels Mutagenese bzw. Phosphomimic-Mutanten und unphosphorylierbaren Mutanten wurden drei putative Serin-Motive in der Plakophilin3 Sequenz untersucht. Die Phosphorylierung des 2. sowie 3. Motives führten zur zytoplasmatischen Lokalisation von PKP3 mit verminderter Desmosomenausbildung, was Zellzwischenräume hervorrief. Die Phosphorylierung dieser Motive führte auch zur Proliferationssteigerung, womöglich über zytoplasmatische Funktionen von Plakophilin3 z.B. bei der Translation. Die Phosphorylierung im 1. Motiv zeigte in den verwendeten Zelllinien HeLa und MCF-7 keinen Einfluss auf die Lokalisation oder Funktion von Plakophilin3. Ein Einfluss auf die Organisation der Aktinfilamente wurde bei keinem der untersuchten Motive beobachtet. Die Bestätigung von Plakophilin3 als Zielprotein der p70-S6-Kinase zeigt, wie die vielfältigen Funktionen von Plakophilin3 bei der Zell-Zelladhäsion, Migration und Proliferation reguliert werden können. Die Plakophilin3/p70-S6K-Interaktion ist besonders im Kontext der Wundheilung relevant, bei der die p70-S6-Kinase durch Wachstumsfaktoren und den PI3K/mTOR-Signalweg aktiviert wird. Plakophilin3 wird in nahezu allen Epithelien exprimiert und zeigt widersprüchliche Assoziationen mit Karzinomerkrankungen. Eine mögliche Erklärung ist die Regulation der Funktion von Plakophilin3 durch die p70-S6-Kinase, die in Tumoren häufig hochreguliert ist.

The aim of this thesis was to investigate the possibility of an interaction between Plakophilin3 (PKP3) and the p70-S6-kinase and whether this interaction has any influence on the localization or function of Plakophilin3. In a second step, putative phosphorylation motifs in the PKP3-sequence and there influence on localization and function were investigated. GST-pulldown-experiments revealed an interaction in-vitro and BiFC-experiments showed an interaction in a cellular environment. Furthermore three conserved serin motifs were identified as putative phosphorylation motifs. For this purpose site-directed mutagenesis was used to generate the according phosphomimic or phospho-deficient PKP3-constructs. The phosphomimic PKP3-constructs of the second and third motif localized more cytoplasmic than the wild type when transfected into MCF-7 and HeLa cells. Also these constructs showed a less desmosomal localization and cause greater inter-cellular gaps. Phosphorylation of the second as well as the third motif also stimulates proliferation as measured with an BrdU-assay. An Influence of Phosphorylation of the first serin motif on localization or function of Plakophilin3 could not be observed. Also there was no drastic influence on actinfilaments after transfection of any described construct. All of the above suggests Plakophilin3 as a new target of the p70-S6-kinase. It is likely that many functions of Plakophilin3 are regulated by p70-S6-kinase. The p70-S6-kinase/Plakophilin3-pathway plays an important role in wound healing. The p70-S6-kinase is activated by growth-factors, such as EGF/Insulin/IGF and the PI3K/mTOR-pathway. PKP3 shows distinct associations with cancer. Its regulation by the p70-S6-kinase, which is frequently up-regulated in cancer, might be an explanation for these associations.