Enhancing the diagnostic security of periprosthetic joint infections by using dithiotreithol, next-generation-sequencing and C9 as a new biomarker

Abstract

One of the most common reasons for revision surgery in orthopedics is the periprosthetic joint infection (PJI). Based on the MSIS criteria, one major factor is finding at least two positive cultures of the same organism. The presence of a biofilm can reduce the diagnostic security and can lead to culture-negative PJIs. Dithiothreitol (DTT) can destabilize a biofilm by reducing the disulfide bonds between the polysaccharides and proteins. As the bacteria survive the DTT treatment, the bacteria-containing solution can be used to cultivate and identify the pathogens. Next-Generation-Sequencing has been proposed to be a useful adjunct technique in diagnosing infection and identifying pathogens. Therefore, in the first part of my thesis, I used possible alternative techniques to facilitate the identification of PJIs in more detail. I compared the DTT-treated explant cultures for bacteria identification with the standard (std.) routine microbiological diagnostic using tissue cultures. Furthermore, I compared the NGS from DTT-solution bacteria cultures with std. routine microbiological tissue culturing. The results of the DTT culturing indicated in 8% of the aseptic cohort possible CN-PJIs. Using NGS, more polymicrobial bacteria were identified as compared to the other techniques, which can be attributed to the high sensitivity of NGS. In summary, it has been shown that the DTT pretreated bacteria culturing and the NGS from DTT treated explants were not superior to the std. microbiological diagnostic using tissue cultures for the identification of a pathogen. Therefore, establishing a new and more reliable methodology to facilitate the detection of PJIs is essential. Using a specific indicator for a more secure PJI analysis could help to improve the treatment of PJI patients. Therefore, a biomarker for PJI identification would be helpful for questionable cases. One of the most promising biomarkers so far is the detection of α-defensin in synovial fluid samples. As the detection of α-defensin showed cross-reactivity with certain crystallopathies and metallosis and is additionally very costly, the need for an alternative biomarker is required. Therefore, in the second part of my thesis, I have been analysed possible novel biomarkers by using immunohistochemical stainings of periprosthetic tissue. I analyzed α-defensin, CD68 as a marker for macrophages, CD66b as a marker for neutrophils, and different proteins of the terminal complement pathway (C3, C5, and C9). With the ROC (receiver operating characteristics) curve, I identified C9 (AUC; area under the curve; of 0.94, sensitivity of 100% and specificity of 89%) as a new possible biomarker for detecting PJIs. To validate C9 as a biomarker for PJI, I used a cohort of 98 patients undergoing hip and knee revisions. The statistical analysis showed a significant difference (p < 0.0001) between the septic and aseptic cohorts. The AUC of 0.84 confirmed that C9 immunohistological staining serves as an excellent biomarker for identifying PJI. The sensitivity of 89% and the specificity of 75% were slightly lower than the α-defensin detection in synovial fluid. By comparing different parameters e.g., type of pathogen, serum CRP level, and implantation time, I showed that the C9 biomarker works independently from these factors. Furthermore, I have analyzed if other typical inflammatory joint conditions such as chondrocalcinosis (CC), Rheumatoid Arthritis (RA), and abrasion particles can influence the sensitivity and specificity of C9 detection for PJI identification. I found that the C9 biomarker could be used in the presence of CC and RA to identify PJIs. With this Ph.D. thesis, I provide the basis for developing a novel biomarker for more accurate detection of PJI to decrease the number of CN-PJIs in the future. Due to the high sensitivity and specificity of C9 immunostaining, I propose using this biomarker in the unclear diagnosis of PJI to secure the treatment suggestion.

Einer der häufigsten Gründe für eine Revisionsoperation in der Orthopädie ist die periprothetische Gelenksinfektion (PGI). Nach den MSIS-Kriterien ist ein wichtiger Faktor der Nachweis von mindestens zwei positiven Gewebekulturen desselben Organismus. Allerdings kann das Vorhandensein eines Biofilms die diagnostische Sicherheit verringern und zu kulturnegativen PGIs führen. Es konnte gezeigt werden, dass Dithiothreitol (DTT) einen Biofilm destabilisieren kann indem es die Disulfidbindungen zwischen den Polysacchariden und Proteinen reduziert. Da die Bakterien die DTT-Behandlung überleben, kann die bakterienhaltige Lösung zur Kultivierung und Identifizierung der Erreger verwendet werden. Next-Generation-Sequenzierung wurde wiederum als nützliche Zusatztechnik für die Diagnose von Infektionen und die Identifizierung von Krankheitserregern vorgeschlagen. Daher habe ich im ersten Teil meiner Doktorarbeit mögliche alternative Techniken untersucht, um die Identifikation von PGI zu verbessern. Ich verglich die DTT-behandelten Explantatkulturen zur Bakterienidentifizierung mit der standardmäßigen mikrobiologischen Routinediagnostik durch Gewebekulturen. Darüber hinaus verglich ich die NGS Ergebnisse der DTT-behandelten Explantatlösung mit der standardmäßigen mikrobiologischen Routine-Gewebekultivierung. Die Ergebnisse der DTT-Kulturen zeigten bei 8% der aseptischen Kohorte mögliche Kulturnegative-PGIs an. Mit NGS wurden im Vergleich zu den anderen Techniken mehr polymikrobielle Bakterien diagnostiziert, was auf die hohe Empfindlichkeit von NGS zurückzuführen ist. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die DTT-vorbehandelte Bakterienkultur und die Lösung für NGS aus DTT-behandelten Explantaten der herkömmlichen mikrobiologischen Diagnostik mit Gewebekulturen zur Identifizierung eines Erregers nicht überlegen war. Daher ist die Entwicklung einer neuen und zuverlässigeren Methodik zur Erleichterung des Nachweises von PGI unerlässlich. Die Verwendung eines spezifischen Indikators für eine sicherere PGI-Analyse könnte dazu beitragen, die Behandlung von PGI-Patienten zu verbessern. Deshalb wäre ein Biomarker für die Identifizierung von PGI in zweifelhaften Fällen nützlich. Einer der bisher vielversprechendsten Biomarker ist der Nachweis von α-Defensin in Synovialflüssigkeitsproben. Da der Nachweis von α-Defensin eine Kreuzreaktivität mit bestimmten Kristallopathien und Metallosen aufweist und zudem sehr kostspielig ist, besteht Bedarf an einem alternativen Biomarker. Daher habe ich im zweiten Teil meiner Arbeit mögliche neue Biomarker anhand von immunhistochemischen Färbungen von periprothetischem Gewebe untersucht. Ich analysierte α-Defensin, CD68 als Marker für Makrophagen, CD66b als Marker für Neutrophile und verschiedene Proteine des terminalen Komplementwegs (C3, C5 und C9). Anhand der ROC-Kurve habe ich C9 (AUC (area under the curve) von 0,94, Sensitivität von 100 % und Spezifität von 89 %) als neuen möglichen Biomarker für die Erkennung von PGI identifiziert. Für die Validierung von C9 als Biomarker für PGI verwendete ich eine Kohorte von 98 Patienten, die sich einer Hüft- und Knierevision unterzogen hatte. Die statistische Analyse zeigte einen signifikanten Unterschied (p < 0,0001) zwischen der septischen und der aseptischen Kohorte. Der AUC von 0,84 bestätigte, dass die immunhistologische C9-Färbung ein hervorragender Biomarker für die Identifizierung von PGI ist. Die Sensitivität von 89 % und die Spezifität von 75 % waren jedoch im Vergleich zum α-Defensin-Nachweis in der Synovialflüssigkeit etwas geringer. Durch den Vergleich verschiedener Parameter, z. B. Art des Erregers, Serum-CRP-Spiegel und Implantationszeit, konnte ich zeigen, dass der C9-Biomarker unabhängig von diesen Faktoren funktioniert. Außerdem habe ich untersucht, ob andere typische entzündliche Gelenkerkrankungen wie Chondrokalzinose (CC), rheumatoide Arthritis (RA) und Metall-Abriebpartikel die Sensitivität und Spezifität des C9-Nachweises bei der Identifizierung von PGI beeinflussen können. Ich habe herausgefunden, dass der C9-Biomarker bei Vorliegen von CC und RA für die Identifizierung von PGI verwendet werden kann. Mit dieser Doktorarbeit habe ich die Grundlage für die Entwicklung eines neuen Biomarkers für eine genauere Erkennung von PGI geschaffen, um hoffentlich die Zahl der KN-PGIs in der Zukunft zu verringern. Aufgrund der hohen Sensitivität und Spezifität der C9-Immunfärbung schlage ich den Einsatz dieses Biomarkers bei der unklaren Diagnose von PGI vor.