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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/2280
Title: Kinetische und strukturelle Untersuchungen der Thiamindiphosphat-abhängigen Enzyme α-Ketosäuredecarboxylase aus Mycobacterium tuberculosis und Oxalyl-CoA-Decarboxylase aus Escherichia coli
Author(s): Werther, Tobias
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2008
Extent: Online-Ressource, Text + Image (kB)
Type: Hochschulschrift
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000014014
Subjects: Elektronische Publikation
Hochschulschrift
Online-Publikation
Zsfassung in engl. Sprache
Abstract: In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängige Carboxylyasen, eine α-Ketosäuredecarboxylase aus Mycobacterium tuberculosis (MtKDC) und eine Oxalyl-CoA-Decarboxylase aus Escherichia coli, kinetisch und strukturell charakterisiert. Das Gen rv0853c des Mycobacterium tuberculosis Stammes H37Rv codiert für eine ThDP-abhängige α-Ketosäuredecarboxylase, einem Enzym, welches im Aminosäureabbau über den Ehrlichweg involviert ist. Untersuchungen zur Substratspezifität verdeutlichten, dass das mykobakterielle Enzym in der Lage ist, ein breites Substratspektrum von verzweigtkettigen und aromatischen α-Ketosäuren umzusetzen. Stopped-flow Kinetiken zeigten, dass die MtKDC allosterisch durch α-Ketosäuren aktiviert wird (Substrataktivierungsverhalten). Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass auch Aminosäuren potente Aktivatoren dieses ThDP-abhängigen Enzyms darstellen. Ein kinetisches Minimalmodell wurde vorgeschlagen und diskutiert. Die strukturellen Aspekte der Aminosäureaktivierung wurden mit Hilfe von Röntgenkleinwinkelstreuung, analytischer Gelfiltration und Circulardichroismus untersucht. Das Gen yfdU von Escherichia coli codiert für eine Oxalyl-CoA-Decarboxylase, ein ThDP-abhängiges Enzym, welches im Oxalatabbau involviert ist. Mit Hilfe eines kontinuierlichen Tests wurden die kinetischen Konstanten des Oxalyl-CoA-Umsatzes in Gegenwart der Inhibitoren Coenzym A und Acetyl-Coenzym A, sowie des Aktivators Adenosindiphosphat bestimmt. Analysen der Kristallstruktur des Enzyms ermöglichten Einblicke in den katalytischen Mechanismus und erlaubten den Vergleich mit dem homologen Enzym aus Oxalobacter formigens.
In the present thesis two thiamine diphosphate dependent carboxy-lyases, a α-keto acid decarboxylase from Mycobacterium tuberculosis and an oxalyl-CoA decarboxylase from Escherichia coli, were kinetically and structurally characterized. The gene rv0853c from Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv is coding for a thiamine diphosphate-dependent α-keto acid decarboxylase (MtKDC), an enzyme involved in the amino acid degradation via the Ehrlich pathway. Steady state kinetic experiments were performed to determine the substrate specificity of MtKDC. The mycobacterial enzyme was found to convert a broad spectrum of branched-chain and aromatic α-keto acids. Stopped-flow kinetics showed that MtKDC is allosterically activated by α-keto acids (substrate activation behavior). Even more, it could be demonstrate that also amino acids are direct and potent activators of this ThDP-dependent enzyme. A kinetic minimal model is proposed and discussed. Experiments with small angle X-ray scattering, analytical gel filtration and circular dichroism shed light on the structural aspects of the amino acid activation. The gene yfdU from Escherichia coli is coding for a putative oxalyl-CoA decarboxylase, a thiamine diphosphate-dependent enzyme potentially involved in the degradation of oxalate. Using a continuous optical assay, the kinetic constants for the conversion of the substrate oxalyl-coenzyme A by the enzyme in absence and presence of two inhibitors, coenzyme A and acetyl-coenzyme A, as well as the activator adenosine 5'-diphosphate have been determined. Analyses of crystal structures of the enzyme revealed some insight into the catalytic mechanism and allowed comparison with the homologous enzyme from Oxalobacter formigens.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/9065
http://dx.doi.org/10.25673/2280
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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