Mitochondriale Differenzierung als Entwicklungsparameter in normalen, geklonten und uniparentalen Kaninchenembryonen am Beispiel des keimzellspezifischen mitochondrialen Markers PG2

Abstract

Um eine frühzeitige Beurteilung der Entwicklungsschritte klonierter Embryonen zu ermöglichen, wurde in dieser Arbeit im Modellorganismus Kaninchen die biochemische Differenzierung und zytoplasmatische Verteilung von Mitochondrien während der frühen embryonalen Entwicklung untersucht. Von besonderem Interesse war die frühe Entwicklung von durch Kerntransfer (sog. reproduktive Klonierung) erzeugten Embryonen. Natürlich gezeugte, im Muttertier oder in vitro weiterentwickelte Embryonen wurden mit Embryonen verglichen, die mit Spenderkernen aus fetalen Fibroblasten, Blastomeren oder adulten Cumuluszellen erzeugt worden waren. Als Parameter für die biochemische Differenzierung der Mitochondrien wurden 3 monoklonale Antikörper eingesetzt: Der gegen ein keimzellspezifisches mitochondriales Epitop gerichtete Antikörper PG2 und die gegen konstitutionelle mitochondriale Epitope in allen Körperzellen gerichteten Antikörper MTC02 oder CoxIV. Nach immunhistochemischen Doppelfärbungen an whole-mount-Präparaten wurden Reaktionsintensität, Reaktionsverteilung und das subzelluläre Reaktionsmuster der Antikörper fluoreszenzmikroskopisch verglichen. Zwischen dem 4- und 16- Stadium - gleichzeitig mit dem Zeitpunkt des Wechsels von maternaler zu selbständiger zygotischer Transkriptionsaktivität (maternal-to-zygotic-transition = MZT) im Kaninchen - fiel im Vergleich zum granulären subzellulären MTC02-Reaktionsmuster ein überwiegend diffuses PG2-Reaktionsmuster auf, das im Gegensatz zu einem in anderen Stadien granulären PG2-Reaktionsmuster stand. Klonierte Embryonen zeigten in frühen Stadien mit allen 3 Antikörpern im Wesentlichen schwächere, inhomogenere und diffusere Reaktionsmuster als normale Embryonen, und erst ab dem Morulastadium ähnliche Reaktionsmuster wie bei normalen Embryonen.

In order to facilitate an early estimation of the developmental potency of cloned mammalien embryos we examined the biochemical differentiation and zytoplasmic distribution of mitochondria during the early embryonic development of the rabbit. Naturally fertilized embryos developing in vivo or in vitro were compared with embryos produced by nuclear transfer using fetal fibroblasts, 64-cell-blastomeres or cumulus cells as nuclear donors. Three different monoclonal antibodies were used as a parameter for the biochemical differentiation of mitochondria: the antibody PG2, which is specific for mitochondria of germcells and the two antibodies MTC02 and CoxIV which are specific for constitutive mitochondrial epitopes of all cell. After double-immunohistochemical staining in whole mount embryos we compared the intensity, the distribution and the subcellular staining pattern in the fluorescent microscope. Between the 4 cell stage and the 16 cell stage - at the time of the transition from maternal to zygotic transcription (MTZ) in the rabbit - we found a more diffuse PG2-staining pattern in comparison with the granular MTC02-staining pattern and the granular PG2-staining pattern at other cell-stages. During early embryonic development of cloned embryos we found - using any of the three antibodies - a weaker staining intensity, a more inhomogenous staining distribution and a more diffuse staining pattern as in normal embryos. Only from the morula-stage on we found similar staining results in cloned embryos as in normal embryos.