Analyse der Genotyp-Phänotyp-Beziehungen von Mitochondrien in Muskelbiopsien und in Cybrids mit "single deletions" mittels Metabolischer Kontrollanalyse

Abstract

Trotz intensiver Bemühungen ist der Zusammenhang zwischen Genotyp und Phenotyp bei Mutationen der mtDNA nicht voll verstanden. Aus verschiedenen Gründen sind die Diagnostik und das Verständnis der Auswirkungen von Mutationen der mtDNA erschwert. Probleme, die einer Aufklärung der Genotyp-Phänotyp-Beziehungen entgegenstehen sind die Mitochondrienproliferation und die zahlreichen Möglichkeiten der methodischen Fehler bei der Untersuchung der Mitochondrien auf enzymatischem und funktionellem Level. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, qualitative und quantitative Genotyp-Phenotyp-Beziehungen bei CPEO-Patienten mit "single deletions" zu ermitteln. So sollte untersucht werden, ob unterschiedliche Deletionen gleiche oder verschiedene mitochondriale Störungen verursachen. Weiterhin bestand die Aufgabe die Flusskontrolle der COX und die von Komplex I auf die mitochondriale Atmungsgeschwindigkeit in menschlichen permeabilisierten Muskelfasern von Normalprobanden und von CPEO-Patienten im Vergleich zu den anderen bioenergetischen zu messen. Zum vollen Verständnis der Genotyp-Phänotyp-Beziehungen ist es wichtig zu wissen, wie sich eine Mutation im mtGenom auf die Funktion der Mitochondrien IN VIVO auswirkt, denn bei der Untersuchung der Mitochondrien im isolierten Zustand muß man von total veränderten Umweltbedingungen für die Mitochondrien ausgehen. So gibt es bis heute keine verlässlichen Daten zu den Kontrolleigenschaften der wichtigsten mitochondrialen Enzyme unter IN VIVO-Bedingungen. In der Skelettmuskulatur von CPEO-Patienten mit "common deletion" fanden sich mit zunehmender Heteroplasmie zunehmende Aktivitäten an Citratsynthase, dem wichtigsten mitochondrialen Leitenzym. Demnach nahm die Mitochondrienmenge in der betroffenen Muskulatur zu. Parallel dazu nahmen die Aktivitäten der Atmungskettenkomplexe I, I+III, II+III, III und der Cytochromoxidase linear ab. Gleichsinnig dazu nahm auch die Mitochondrienfunktion, gemessen an der Pyruvat- und auch der Succinatatmung, ab. Diese linearen Abnahmen waren unabhängig von der Deletionsgröße. Anhand dreier Patienten mit gleichen Heteroplasmiegraden aber stark unterschiedlicher Deletionsgröße, konnte gezeigt werden, daß die Deletion der tRNA-Gene von entscheidender pathophysiologischer Bedeutung ist, und das die zusätzliche Deletion von Proteingenen keine zusätzliche Schädigung verursacht. In "skinned fibres" gesunder Kontrollen war CoCOX (0,23 ± 0,07) doppelt so hoch, wie CoKomplex I (0,11 ± 0,02). Damit in Übereinstimmung wurde gefunden, daß die state 3 Atmung linear mit der COX Aktivität korreliert und daß es keine überschüssige COX-Aktivität zu geben scheint. Wurde die Kontrolle der COX in Muskelhomogenat mit NADH als Substrat bestimmt, so vergrößerte sich ihre Kontrolle (CoCOX = 0,74), entsprechend der Verkleinerung der metabolischen Systems auf die Atmungskette. In CPEO-Patienten stieg die Kontrolle beider Enzymer deutlich an (CoKomplex I = 0,33; CoCOX = 0,31). Bei der Untersuchung außerhalb intakter Zellen wurden die separat bestimmten Dissoziationskonstanten Kd = 3 µM Cyanid, Kd = 93 µM Azid und Kd = 94 µM Amytal für die nichtlineare Fittung der Daten verwendet. In intakten Zellen stiegen die Dissoziationskonstanten jedoch an (Kd = 12,9 µM KCN und Kd = 160 µM Azid), was wahrscheinlich am Einfluß des Zellmembranpotentials auf die Verteilung der negativ geladenen Inhibitormoleküle, weshalb man in diesem Fall von scheinbaren Dissoziationskonstanten sprechen muß. Mit Hilfe dieser Konstanten konnten erstmals Flußkontrollkoeffizienten der Cytochromoxidase in intakten Zellen also unter IN VIVO-Bedingungen bestimmt werden. Es ergaben sich für die Cytochromoxidase in intakten humanen Zellen (Myoblasten, CoCOX = 0,32/0,32; glatte Gefäßmuskelzellen, CoCOX = 0,25/0,3) und in Cybrids (CoCOX = 0,31 ) erhöhte Flußkontrollkoeffizienten. Diese stiegen nach Entkopplung entsprechend der Verkleinerung des metabolischen Systems stark an (Cybrids, CoCOX = 0,74; Myoblasten, CoCOX = 0,83; Glatte Gefäßmuskelzellen CoCOX = 0,88). Auch nach Glukosezusatz zu den Myoblasten und Cybrids stieg die Flußkontrolle an, was mit der Konkurrenz der Mitochondrien und der Glykolyse um ADP zu erklären ist. In Cybrids mit der "common deletion" und einem Heteroplasmiegrad von 47 % stieg die Flusskontrolle der Cytochromoxidase von CoCOX = 0,31 im Wildtyp auf CoCOX = 0,59 an.

Diseases due to mtDNA mutations are well-defined clinical syndromes and their genetics is known; however, the pathogenesis and the relation between molecular target of the mutation and clinical phenotype are often obscure. Besides the mtDNA mutation in mitochondrial encephalomyopathies there are also secondary disturbance with different neurodegenerative diseases and aging. Beyond 800 nDNA gene can affect the function of mitochondrial genome, and it is to complex to grasp the every genetic mutation with present method. With genetic method much acute disturbance can not be detected, e.g. that resulting from ischaemia, inflammation and rhabdomyolse . In addition the mitochondria proliferation make it difficult to understand the relationship between genotype and phenotype. This work investigate the relationship between genotype and phenotype on patient with single deletion. It would be researched whether the different deletion result in different mitochondrial disorder. We investigated flux control coefficient of the COX (Cocox) and the complex I (CocomplexI) in skinned fibre from CEPO patient and the control and measured other bioenergetics parameter, e.g. state 3 respiration and enzyme activity of respiration chain. For better understanding of the relationship between genotype and phenotype it is necessary to know how the mutation in mtDNA affect the function of mitochondria in vivo, because the environment of isolated mitochondria is very different from that in vivo, e.g. viscosity, metabolite concentration and complexity of metabolism system. To date there is no reliable flux control coefficient of the important respiration chain enzyme in vivo .So we investigated flux control coefficient of the COX in intact human cells (myoblast and vascular smooth muscle cell) and cybrids with common deletion under different metabolic condition and verify whether it is possible to quantify the pathologic change of mitochondrial function with flux control coefficient. In skeletal muscles from CEPO patients with common deletion it was found that the activity of citratsynthase, the mark enzyme of mitochondria, rose with heteroplasmy. It suggests that mitochondrial amount increase in the suffered muscles. But there was a parallel and linear decrease in the activity of respiration chain complex I, I+III, II+III, III, COX and mitochondrial function (pyruvate- and succinate-depend respiration). And this decrease did not rely on the deletion size. The data from three patients with same heteroplasmy grade but very different deletion size showed that the deletion of tRNA gene determined pathology and additional deletion of protein gene did not cause extra damage. In skinned fibres from control the Cocox (0,23 ± 0,07) was double of the Cocomplex I. It accorded with that the state 3 respiration linearly correlated with COX activity and there seemed no surplus of COX activity. When Cocox was assayed in muscle homogenate with NADH as substrate, it enlarged to 0,74 corresponding with the smaller metabolic system of respiration chain. In CEPO patient both flux control coefficient significantly increased (Cocox = 0,31; Cocomplex I = 0,33). These separately determined dissociation constant (Kd) that were applied to fit the data outside intact cell, were 3 µM Cyanid, 93 µM Azid and 94 µM Amytal. In intact cell there were higher Kd (Kd = 12,9 µM KCN and Kd = 160 µM Azid) than those above mentioned, because the cell membrane potential possibly has influence over distributing the inhibitor molecule with negative charge, therefore it is called seeming dissociation constant to differentiate it from real dissociation constant. With these constant the Cocox could be determined in intact cell and so in vivo for the first time. The Cocox was 0,32 in myoblast, 0,3 in vascular smooth muscle cell and 0,31 in cybrid and after uncoupling these increased very much corresponding to the smaller metabolic system ( Cocox = 0,74 in cybrid, 0,83 in myoblast and 0,88 in vascular smooth muscle cell). The cybrid with common deletion and 47% heteroplasmy grade had a higher Cocox than wild type cybrid.