Untersuchungen zur Chemotherapie-Resistenz des malignen testikulären Keimzelltumors

Abstract

Der maligne testikuläre Keimzelltumor (TKZT) ist die häufigste Tumorerkrankung junger Männer im Alter zwischen 15 und 35 Jahren. Durch die auf Cisplatin basierende Chemotherapie werden etwa 80% der Patienten mit fortgeschrittenem, metastasiertem TKZT geheilt. In etwa 20% der Fälle, vor allem bei nichtseminomatösen TKZT, kommt es zur Entwicklung einer Cisplatin-Resistenz, welches mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. Ziel dieser Arbeit war es, durch Untersuchungen auf zellulärer bzw. molekularer Ebene zur Aufklärung der Ursachen einer Cisplatin-Resistenz beim TKZT beizutragen. Es wurden vergleichende Analysen an nichtseminomatösen TKZT-Zelllinien und abgeleiteten Nacktmaus-Tumor-Xenograften mit unterschiedlicher Cisplatin-Sensitivität durchgeführt. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass eine Cisplatin-Behandlung in equitoxischer Dosis sowohl in sensitiven als auch in resistenten TKZT-Zellen den apoptotischen Zelltod auslöst. Die Behandlung mit einer niedrigen, klinisch relevanten Cisplatindosis, welche in den sensitiven TKZT-Zellen zur Apoptose-Induktion führte, wurde jedoch von den resistenten TKZT-Zellen toleriert. Die Cisplatin-Resistenz der resistenten TKZT-Zellen ist daher durch eine verminderte Induktion der Apoptose begründet. Die Assoziation von Apoptose-Induktion und Cisplatin-Sensitivität bzw. Tumor-Regression konnte im Nacktmaus-Tumormodell in vivo unter klinisch relevanten Bedingungen bestätigt werden. Die Analyse relevanter Parameter wie DNA-Cisplatin-Adduktbildung, Zellzyklusarretierung, Expression von p53 sowie von Proteinen der Bcl2-Familie und Proteinen des Mismatch repair pathways ergaben keine Unterschiede bezüglich der differentiellen Induzierbarkeit der Apoptose und Cisplatin-Sensitivität. Die Untersuchungen zur Aktivierung der Caspasen zeigten, dass die Cisplatin-induzierte Apoptose in sensitiven TKZT-Zellen über den intrinsischen Caspase-9/Apoptosom-assoziierten Pathway, und nicht über den extrinsischen, Caspase-8/DISC-assoziierten Pathway initiiert wird. In den resistenten TKZT-Zellen wurden eine fehlende Caspase-9-Aktivierung sowie verminderte Aktivitäten der Caspasen -2 und -3 beobachtet. Eine Inhibierung der Caspase-9-Aktivierung in sensitiven TKZT-Zellen führte zu einer ähnlich differenziellen Caspasen-Aktivierung wie in den primär resistenten TKZT-Zellen und zur Etablierung einer Cisplatin-Resistenz. Die ungehinderte Aktivierung der Caspase-9 vermittelt daher die Cisplatin-Sensitivität in TKZT-Zellen. Die Analysen zur Rolle des embryonalen Transkriptionsfaktors Oct-3/4 zeigten, dass embryonale Karzinomzellen (EC-Zellen), die putativen Tumorstammzellen des nichtseminomatösen TKZT, durch die Oct-3/4-Expression in ihrem undifferenzierten embryonalen, Cisplatin-sensitiven Zustand gehalten werden. Durch einen frühen Differenzierungsschritt, welcher den vollständigen Verlust von Oct-3/4 voraussetzt, kommt es zur Etablierung der Cisplatin-Resistenz in EC-Zellen. Diese Veränderung war wiederum mit einer fehlenden Caspase-9-Aktivierung assoziiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Assoziation zwischen dem Verlust der Oct-3/4-Expression, der veränderten Regulation der Caspasen-Aktivierung und der Etablierung der Cisplatin-Resistenz einen funktionalen und induzierbaren Prozess in EC-Zellen darstellt. In Verbindung mit den in vivo Untersuchungen der Tumor-Xenografte führten diese Analysen darüber hinaus zur Identifizierung und Charakterisierung eines noch unbeschriebenen Zelltyps - den Cisplatin-resistenten Oct-3/4-negativen EC-Zellen - die vermutlich auch für das Wachstum metastasierter, Chemotherapie-resistenter nichtseminomatöser TKZT in Patienten eine Schlüsselrolle spielen.

Testicular germ cell tumor (TGCT) is the most common malignancy of young men at age between 15 and 35 years. About 80% of patients suffering from advanced TGCT can be cured by cisplatin-based chemotherapy. However, in 20% of cases, particularly in nonseminomatous TGCT, a cisplatin-resistance is developed. This is associated with a poor prognosis. It was the aim of this study to investigate the reasons for cisplatin-resistance in TGCT on a cellular and molecular level. Several comparative analyses were performed on nonseminomatous TGCT cell lines and derived nude mice tumor xenografts with differential cisplatin-sensitivity. First it was shown, that cisplatin-treatment in equitoxic doses induces apoptotic cell death in sensitive as well as resistant TGCT cells. However, cisplatin-treatment with low, clinical relevant doses, which led to induction of apoptosis in sensitive TGCT cells, was tolerated in resistant TGCT cells. Therefore, cisplatin-resistance of TGCT cells is based on decreased induction of apoptosis. The association between apoptosis-induction and cisplatin-sensitivity and tumor regression was confirmed in vivo under clinical relevant conditions using the nude mice tumor model. Analyses of DNA-platination, cell cycle perturbations, expression of p53 and Bcl2-family proteins and mismatch repair pathway proteins revealed no differences regarding the differential induction of apoptosis and cisplatin-sensitivity. Investigation regarding the activation of caspases showed that cisplatin-induced apoptosis in sensitive TGCT cells is mediated by the intrinsic, caspase-9/apoptosom-associated pathway and not by the extrinsic, caspase-8/DISC-associated pathway. In resistant TGCT cells impaired caspase-9 activation and decreased activities of caspases-2 and -3 were observed. Inhibition of caspase-9 activation in sensitive TGCT cells led to similar reduced activation of caspases as in primary resistant TGCT cells and to cisplatin-resistance. Therefore, non-impaired activation of caspase-9 mediates cisplatin-sensitivity in TGCT cells. Analyses regarding the role of the embryonal transcription factor Oct-3/4 showed that embryonal carcinoma cells (EC cells), the putative tumor stem cells of the nonseminomatous germ cell tumor, are hold in their embryonal cisplatin-sensitive state by the expression of Oct-3/4. Cisplatin-resistance in EC cells is established by an early differentiation-step which requires the ultimate loss of Oct-3/4 expression. In addition, this alteration was associated with impairment of caspase-9 activation. It could be shown that the association between loss of Oct-3/4 expression, altered regulation of caspase activation and establishment of cisplatin-resistance represents a functional and inducible process in EC cells. Furthermore, these analyses in association with in vivo investigation of the tumor xenografts have led to the identification and characterisation of an unknown cell type - the cisplatin-resistant Oct-3/4-negative EC cells - which presumably are responsible for the growth of advanced chemotherapy-resistant nonseminomatous germ cell tumors in patients.