Characterization of Nup155 and Mel28 in nuclear envelope assembly in vitro

Abstract

In mehrzelligen Organismen zerfällt die Kernhülle zu Beginn der Zellteilung und rekonstituiert sich am Ende neu. In der vorliegenden Arbeit wurden Nup155 und Mel28 bei der Rekonstitution der Kernhülle in X. laevis Eiextrakten charakterisiert. Nup155 ist ein Nukleoporin, ein Bestandteil der Kernporenkomplexe. Mel28 ist ein weitgehend unbeschriebenes Protein. In einer zeitaufgelösten Reaktion der Rekonstitution von Zellkernen in vitro, assoziierte Nup155 erst im zweiten funktionellen Schritt nach Nup107 und Pom121 mit dem Chromatin. Bei der Verwendung von Nup155-freiem Eizytosol zur Bildung von Kernen, konnten Nup107 und Pom121 weiterhin an Chromatin binden, allerdings wurden sie, wie alle weiteren untersuchten Nukleoporine nicht in Kernporenkomplexe an der Chromatinperipherie integriert. Bei Fehlen von Nup155 konnten Membranvesikel an Chromatin binden, fusionierten aber nicht zu einer geschlossenen Kernmembran. Defekte beim Aufbau von Kernporenkomplexen und der Fusion der Kernmembranen in Abwesenheit von Nup155 konnten durch Zugabe von rekombinantem Nup155 aufgehoben werden. Dies zeigte, dass die beobachteten Phänotypen spezifisch auf die Funktion von Nup155 zurückzuführen waren. Bei der Immunpräzipitation von Mel28 und Nup107 in X. laevis Eizytosol, wurde eine wechselseitige Interaktion der Proteine festgestellt. Bei der Rekonstitution von Kernen in vitro in Mel28-freiem Zytosol, konnte keines der untersuchten Nukleoporine an Chromatin binden. Diese Arbeit erweitert das gegenwärtige Model des Aufbaus der Kernhülle nach der Mitose durch die Entdeckung, dass die Abwesenheit eines löslichen Nukleoporins, Nup155, die Errichtung der Kernporenkomplexe und die Formierung einer geschlossenen Kernmembran inhibiert. Es wird angenommen, dass Nup155 und Pom121 zu einem Kontrollmechanismus beitragen, der die Bildung von Kernporenkomplexen und Kernmembranen zu einer funktionellen Kernhülle koordiniert. Die derzeitigen Daten legen nahe, dass Mel28 essenziell für die Assoziation von Nukleoporinen mit dem Chromatin und somit notwendig für den Aufbau von Kernporenkomplexen ist. Die hier gezeigten Ergebnisse legen nahe, dass Mel28 der Anker für Kernporenkomplexe am Chromatin und damit gegebenenfalls in der Kernhülle sein könnte.

In metazoa the nuclear envelope (NE) disassembles at the onset of cell division and reforms around decondensing chromatin. In this study, the roles of Nup155 and Mel28 in NE assembly were characterized in the X. laevis egg extract system. Nup155 is a nucleoporin, a component of the nuclear pore complex (NPC). Mel28 is a largely uncharacterized protein. In an NE assembly time course experiment, Nup155 was recruited to developing NPCs in the second step, together with a well characterized subset of nucleoporins. Nup107 and Pom121 bound to chromatin prior to Nup155 but like all other nucleoporins investigated, they failed to assemble into NPCs under this condition. Further, it was shown that nuclear membrane vesicles docked to chromatin upon Nup155 depletion but did not fuse to form continuous nuclear membranes. Defects in NPC assembly and nuclear membrane fusion were restored by addition of recombinant Nup155, demonstrating that the described phenotypes were specifically caused by Nup155 depletion. Mel28 is also linked to nucleoporins. Mel28 and Nup107 co-immunoprecipitated from X. laevis egg extracts. In NE assembly reactions with Mel28-depleted cytosol none of the investigated, soluble nucleoporins were recruited to chromatin templates. Under these conditions, the integral membrane protein Pom121 also failed to be incorporated into an NE. In summary, this work extended the current model of postmitotic NE assembly by demonstrating that the absence of the soluble nucleoporin Nup155 inhibits NPC formation and nuclear membrane fusion. Nup155 and Pom121 are suggested to participate in a checkpoint that coordinates NPC assembly and nuclear membrane fusion to form a functional NE. Furthermore, present data indicate that Mel28 is essential for nucleoporin association with chromatin, and thereby required for NPC assembly. Based on the present data, we hypothesize that Mel28 may constitute an anchor for NPCs at chromatin and thereby in the NE.