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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/2581
Title: Generation of transgenic mice with regulated expression of manganese superoxide dismutase (MnSOD)
Author(s): Loch, Tomasz
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2006
Extent: Online-Ressource, Text + Image (kB)
Type: Hochschulschrift
Language: English
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000010674
Subjects: Elektronische Publikation
Hochschulschrift
Online-Publikation
Zsfassung in dt. Sprache
Abstract: Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zum besseren Verständnis der physiologischen Rolle des mitochondrialen Enzyms Mangan Superoxid Dismutase (MnSOD/SOD2). MnSOD ist das erste Enzym in der Kette der mitochondrialen antioxidativen Abwehr und die Ausschaltung des MnSOD Gens in Mäusen führt zur frühen perinatalen Letalität. Das Ziel dieser Arbeit war in vitro und in vivo Systeme zur regulierten MnSOD Expression zu etablieren. Im Zellkulturmodel zur MnSOD Überexpression wurde eine zweifache Erhöhung des MnSOD Expressionslevels beobachtet. Die Expression anderer Enzyme der anti-oxidativen Abwehr (CuZnSOD, CAT, GPX) blieb unverändert. Die erhöhte MnSOD Aktivität führte zu einer verminderten Apoptoserate nach Induktion mit H2O2 oder durch Hyperoxie. Dagegen war die Doxorubicin-induzierte Apoptose unter MnSOD Überexpression leicht erhöht. Ein unerwarteter Effekt wurde in primären MnSOD defizienten (MnSOD-/-) Mausfibroblasten beobachtet. Zunächst konnte gezeigt werden, dass MnSOD-/- Zellen tatsächlich höhere Mengen an freien Radikalen produzierten und empfindlicher als die Wildtyp Zellen auf Hyperoxie reagierten. Die MnSOD-/- Fibroblasten waren jedoch resistent gegenüber H2O2- oder Doxorubicin-induzierten Apoptose. Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche Involvierung der MnSOD in die Ceramid-gesteuerte Apoptose und in die Aufrechterhaltung der Balance zwischen Nitritoxid und Peroxydnitrit Levels hin. Weiterhin zeigten MnSOD defiziente Zellen eine verlangsamte Seneszenz. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Ergebnisse der in vitro Untersuchungen eine zentrale Rolle der MnSOD in der Regulierung des zellulären oxidativen Stresses sowie der Apoptose- und Seneszenz-Vorgängen unterstützen. Als erster Schritt zur Etablierung eines adäquaten Tiermodells zur regulierten MnSOD Expression wurde ein transgener "Ausgangsmausstamm" SOD/TRE generiert. Mittels homologer Rekombination wurde der endogene Genlocus durch eine Expressionskassette ersetzt. Diese Kassette beinhaltet die MnSOD cDNA, der ein basaler Genpromotor inklusive eines Tetracyclin-responsiven-Elements (TRE) vorgesetzt wurde. Eine regulierte MnSOD Expression kann in den transgenen Tieren nur in Anwesenheit eines Tetracyclin-Regulators (TetR) stattfinden. Ohne weitere Verkreuzung wurde der hier generierte SOD/TRE Mausstamm als ein konventioneller Knockout Stamm verwendet. Wie erwartet hat die vollständige MnSOD Defizienz in den SOD/TRE Homozygoten zur frühen Mortalität und phenotypischen Veränderungen wie reduzierte Körpergröße und Gewicht, sowie motorische Störungen geführt. Des Weiteren wurde eine starke Erhöhung der ANF-Expression in den Herzen der 3 Tage alten Tiere beobachtet. Im Epicardium der analysierten Herzen wurden auch verstreute TUNEL-positive apoptotische Zellen beobachtet. Entgegen den phenotypischen Herzveränderungen, die zuvor bei anderen MnSOD Mutanten beschrieben worden sind, weisen die hier präsentierten immunhistochemischen Analysen nicht auf einen ursächlichen Zusammenhang zwischen der Apoptose in Herzen und dem Ausfall der Herzfunktion und Tod der homozygoten MnSOD-/- Tiere hin. Um den Einfluss einer verminderten MnSOD Aktivität auf die Herzfunktion zu studieren, wurden anschließend heterozygote SOD/TRE Tiere analysiert. Es zeigte sich, dass die MnSOD Enzymaktivität um 30 bis 40% reduziert war. Diese verminderte Aktivität der mitochondrialen Dismutase hatte keine Aktivitätsveränderungen der CuZnSOD, CAT oder GPX zu Folge. Diese relativ milde 30% Reduktion der MnSOD Aktivität führte jedoch zu einer ca. 20% Einschränkung der linksventrikulären Herzfunktion, wie an Herzen von 6 Monate alten Tieren mittels Echokardiographie demonstriert werden konnte. Nach Behandlung der heterozygoten SOD/TRE Mutanten mit einem cytotoxischen Medikament, dem Doxorubicin, konnten in den Herzen der behandelten Tiere Apoptoseinduktion und ektopische ANF Expression beobachtet werden. Dabei waren die apoptotischen Zellen auf einige Bereiche des Epicardiums begrenzt, die ANF Expression dagegen wurde im gesamten Herzen detektiert. Darüber hinaus wurden seneszente endotheliale und glatte Muskelzellen mittels einer Seneszenz-spezifischen ß-Gal-Anfärbung in den proximalen Herzgefäßen sichtbar gemacht. Die verminderte Resistenz gegenüber Doxorubicin-induziertem oxidativem Stress und das Auftauchen seneszenter Zellen traten nur in Gefäßen der heterozygoten Tiere auf. Das Herzgewebe selbst wies keine seneszenten Zellen auf. Insgesamt dokumentieren die an den heterozygoten MnSOD Mutanten gewonnenen Daten zum ersten Mal, dass eine partielle MnSOD Defizienz bereits die Herzfunktion beeinträchtigt und der oxidative Stress zur vaskulären Pathogenese beitragen kann. Der SOD/TRE Mausstamm wurde weiterhin zur Generierung eines Tierstamms, SOD/αMHC tTA, verwendet, in dem die MnSOD Expression nur im Myocardium stattfindet; die übrigen Gewebe bleiben MnSOD defizient. Die herzspezifische MnSOD Expression sollte reversibel und zum beliebigen Zeitpunkt durch Tetracyclingabe im Trinkwasser abgeschaltet werden können. Die Analyse der aus Herzgewebe der transgenen Tiere isolierten mRNA zeigte, dass von dem inserierten Konstrukt ein mRNA-Transkript von korrekter Größe produziert wird. Die Transkription konnte durch Tetracyclingabe im Trinkwasser vollständig unterdrückt werden. Diese regulierte MnSOD Expression konnte ebenso auf Proteinebene dokumentiert werden. Die hier generierten SOD/αMHC tTA homozygoten Tiere zeigten jedoch eine Überlebensdauer von ca. 14 Tagen nach der Geburt und wiesen vergleichbare phenotypische Veränderungen, wie die SOD/TRE homozygoten Knockout Mäuse auf. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit in vivo und vitro Experimente durchgeführt, die zum Verständnis der MnSOD Funktion in zellulären und physiologischen Prozessen beitragen. Die hier etablierten Tiermodelle, SOD/TRE und SOD/αMHC tTA stellen ausgezeichnete Werkzeuge, die die Erforschung der Rolle der MnSOD in vielen pathologischen Prozessen, gewebsspezifisch und zu definierten Zeitpunkten möglich machen.
Manganese superoxide dismutase (MnSOD) is the only antioxidant enzyme which is indispensable for the existence of higher eukaryotes. To gain better insight into the essential role of MnSOD, I developed a conditional transgenic mouse strain in which MnSOD expression was put under the control of the tetracycline regulatory system. The present work describes the generation of the transgenic mouse strain and characterizes consequences of MnSOD suppression for the physiology of the genetically altered animals. Furthermore, I describe the effects of MnSOD overexpression and deficiency in different cell culture systems. My results demonstrate that a two-fold higher activity of MnSOD had no influence on activities of other antioxidant enzymes, namely CuZnSOD, CAT and GPX. As expected, the increased level of MnSOD expression protected cells from death under hyperoxic conditions. It also prevented apoptosis induced by hydrogen peroxide administration. Unexpectedly, however, overexpression of MnSOD did slightly enhance doxorubicin-induced programmed cell death although I observed an almost complete inhibition of apoptosis induced by doxorubicin or hydrogen peroxide in primary fibroblasts isolated from MnSOD-/- mice. These results suggest an involvement of MnSOD in ceramide mediated apoptosis and in the regulation of the balance between nitric oxide and peroxynitrite. These findings represent a new aspect of the regulation of programmed cell death. I also detected that MnSOD deficient cells contained higher level of free radicals and were more susceptible to hyperoxia. Surprisingly, but in accordance with the proposed role of hydrogen peroxide in senescence, MnSOD-/- fibroblasts appeared to senesce slower than corresponding wild type cells. Taken together, the results of in vitro studies demonstrated a central role of MnSOD in the regulation of cellular oxidative stress and revealed that MnSOD is indispensable for the progression of apoptosis and senescence. In order to generate an animal model for the regulated expression of MnSOD four strains of transgenic mice were produced. Two of them showed a comparatively low expression of SOD and an ineffective regulation of SOD transcription. One of the remaining strains was used to study the effects of a partial and complete MnSOD deficiency in vivo (SOD/TRE) while the last strain allowed a regulated MnSOD expression in the heart (SOD/αMHC tTA). In the absence of an additional allele, which carries the tetracycline receptor to achieve tissue specific or ubiquitous expression of MnSOD, the SOD/TRE strain might be used as a constitutive knock-out model for SOD. In the presence of the tetracycline receptor, however, the expression of MnSOD can be reversibly switched on and off by administration of doxycycline in drinking water. Complete MnSOD deficiency in homozygous SOD/TRE mice led to early-onset lethality and to massive phenotypical changes as indicated by a reduced body size and weight together with neurological abnormalities. Strong up-regulation of ANF expression in hearts of 3 days old animals was observed. The same hearts showed a slightly increased rate of apoptosis, although TUNEL-positive cells were rare and accumulated only in the epicardium. Despite earlier description of phenotypical changes, my immunohistochemical stainings suggest that apoptosis in the hearts of MnSOD-/- mice is not the primary cause of cardiac failure. Heterozygous SOD/TRE mice showed a 30-40% reduced MnSOD activity in the heart, brain and liver. This attenuation of mitochondrial dismutase did not affect the activity of CuZnSOD, CAT or GPX. Interestingly, the 30% reduction of MnSOD activity in the hearts of 6 months old mice clearly reduced the cardiac performance of heterozygous mutant SOD mice. Left ventricle fraction shortening and fractional area change were decreased in these animals by 26% and 21%, respectively. Furthermore, treatment with doxorubicin, a cytotoxic drug which causes heart dilation, induced apoptosis in the hearts of SOD/TRE heterozygotes and stimulated expression of ANF. The first effect was confined to restricted areas of epicardium, the latter was detectable throughout the heart. Senescence-associated β-galactosidase staining revealed that endothelial and smooth muscle cells in vessels proximal to the heart were less resistant to the stress induced by doxorubicin and displayed a senescent phenotype. In contrast, the heart tissue itself showed no signs of senescence in heterozygous SOD/TRE or in wild type mice. Taken together, my results demonstrate for the first time that even a partial reduction of MnSOD activity might impair heart function and might contribute to vascular pathogenesis. SOD/αMHC tTA homozygous mice survived up to 14 days and showed the same phenotypical changes as homozygous SOD/TRE and knock-out mice, which have been constructed previously. I found that the transcription of the engineered SOD allele was readily regulated in vivo by administration of doxycycline in drinking water and gave rise to a transcript of the predicted size, which generated a protein of the expected molecular weight. Regulation was shown to be effective also at the protein level. Since transcription of the tetracycline receptor was driven by α-myosin heavy chain promoter, expression of the transgene was achieved exclusively in the heart thereby successfully establishing a mouse model with heart-specific regulated expression of MnSOD. In the presented work I described experiments performed in vivo and in vitro, which contribute to the understanding of the function of MnSOD in cellular and physiological processes. The SOD/TRE and SOD/αMHC tTA animal models generated in the course of this work will provide convenient research tools which might help to elucidate the role of MnSOD in many pathological processes in various tissues at different time points.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/9366
http://dx.doi.org/10.25673/2581
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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