Gezielter Proteinabbau in Pflanzen mittels chimärer E3-Ubiquitin-Ligasen

Abstract

Der gezielte Abbau von Proteinen in zellulärer Umgebung erlaubt direkte Rückschlüsse auf deren Wirkung in komplexen Signalkaskaden oder Pathomechanismen. Techniken auf Basis von DeGradFP (Degradation of fluorescent proteins) wurden verwendet, um den gezielten kompartimentspezifischen Proteinabbau in transgenen Pflanzen nachzuweisen und Auswirkungen des Abbaus pathogener Effektorproteine zu analysieren. Abbauversuche der Zielproteine EYFP-CENH3 bzw. SAP11-GFP5 zeigten, dass sich chimäre E3-Ligasen für die Degradation kernlokalisierter Proteine eignen bzw. SAP11-spezifische Phänotypen abgemildert werden können. Hinsichtlich des Abbaus einer pathogenen Methyltransferase wurden Einzeldomänenantikörper mit millimolarer Bindungsaffinität durch Phagen-Display selektiert. Der erfolgreiche Einsatz einer Peptidmembran in der Antikörperselektion wurde gezeigt und könnte zukünftig die Herstellung von Bindeproteinen gegen schwierige Ziele (Membranproteine oder hochmolekularer Proteine) verbessern.

The targeted degradation of proteins in cellular environments allows direct conclusions about their effect on complex signaling cascades or pathological mechanisms. Techniques based on DeGradFP (Degradation of fluorescent proteins) were used for targeted compartment-specific protein degradation in transgenic plants and to analyze the effects of degradation of pathogenic effector proteins. Degradation experiments of the target proteins EYFP-CENH3 and SAP11-GFP5 showed that chimeric E3 ligases are suitable for the degradation of nuclear-localized proteins and that SAP11-specific phenotypes can be mitigated. In prospect of the degradation of a pathogenic methyltransferase, single-domain antibodies with millimolar binding affinity were selected using phage display. The successful use of a peptide membrane for biopanning has been demonstrated. It could, in the future, improve the production of binding proteins against challenging targets (membrane or high molecular weight proteins).