In-vitro-Untersuchungen zur Zellverträglichkeit und antikoagulierenden Wirkung von carboxymethylierten und nicht carboxymethylierten sulfatierten Hyaluronsäuren und natürlichen Huminsäuren

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind In-vitro-Untersuchungen zur Wirkung höhermolekularer polyanionischer Verbindungen auf die Blutgerinnung und auf die Vitalität von U937-Zellen. Bei den verwendeten Testsubstanzen handelt es sich um sulfatierte Hyaluronsäure (S-Hya-15), carboxymethylierte sulfatierte Hyaluronsäuren (CMS-1, CMS-2) und Torfhuminsäuren (THS-A1, THS-A2). Ausgangssubstanz für die sulfatierten Verbindungen ist Hyaluronsäure bzw. ihr carboxymethyliertes Derivat. Durch Sulfatierung mit einem SO3/Dimethylformamid-Komplex werden die sulfatierten Hyaluronsäureverbindungen erhalten. Die Torfhuminsäuren stammen aus dem Altteicher Moor in Sachsen und werden nach einem konventionellen Verfahren durch Alkaliextraktion und Säurefällung gewonnen. Die Testsubstanzen werden in Humancitratplasma auf ihre antikoagulierende Wirkung mit den Gruppentests Thrombinzeit (Thrombin-Fibrinogen-Reaktion), aktivierte partielle Thromboplastinzeit (intrinsisches System) und Prothrombinzeit (extrinsisches System) untersucht. Außerdem wird die Thrombinzeit in reiner Fibrinogenlösung bestimmt. Die stärkste gerinnungshemmende Wirkung besitzen S-Hya-15 und die hochsulfatierte CMS-1, gefolgt von der niedrigsulfatierten CMS-2. Eine deutlich geringere Wirkung in allen Gruppentests haben die Torfhuminsäuren A1 und A2. Die antikoagulierende Wirkung aller Testsubstanzen wird durch Protaminsulfat antagonisiert. Untersuchungen zur Zellverträglichkeit der Testsubstanzen in U937-Zellen ergaben generell eine niedrige Cytotoxizität. Die halbmaximale cytotoxische Konzentration (CC50) der sulfatierten Testsubstanzen liegt nach einer Einwirkungszeit von 24 h bei 37°C im Milligrammbereich (>10 mg/ml). Nach 96-stündiger Einwirkung zeigten S-Hya-15 und CMS-1 (12,8 mg/ml) eine signifikante antiproliferative Wirkung. Die Membrantoxizität der Verbindungen ist so gering, dass keine halbmaximale [3H]Arachidonsäure-Freisetzung bestimmt werden kann. Als Kenngröße wird daher die RC5 verwendet, d.h. die Substanzkonzentration, die bei den Zellen 5 % der maximal möglichen Arachidonsäure-Freisetzung hervorruft. Auf diese Weise ergibt sich für die Membrantoxizität der Testverbindungen nach einer Einwirkungszeit von 24 h bei 37°C folgende Rangfolge: THS-A1 (RC5 = 1,5 mg/ml) > THS-A2 > S-Hya-15 > CMS-1 = CMS-2 (RC5 > 30,0 mg/ml). Insgesamt erweisen sich die carboxymethylierten sulfatierten Hyaluronsäuren CMS-1 und CMS-2 als effektive und zellverträgliche Hemmstoffe der Gerinnung. Ihre antikoagulierende Wirkung hängt eindeutig vom Sulfatierungsgrad der Verbindungen ab (CMS-1 > CMS-2), aber übersteigt nicht die Effektivität der sulfatierten Hyaluronsäure.

The objective of the present study is to investigate the effect of higher-molecular polyanionic compounds on the blood coagulation in vitro and on the vitality of U937 cells. The test substances are sulfated hyaluronic acid (S-Hya-15), carboxymethylated sulfated hyaluronic acids (CMS-1, CMS-2) and peat humic acids (THS-A1, THS-A2). As starting substances for the preparation of the sulfated polyanionic compounds, hyaluronic acid and its carboxymethylated derivative were used, respectively. The sulfated compounds were obtained by sulfation with a sulfur trioxide/dimethyl-formamide complex. Humic acids were prepared from the peat of the Altteich peatland (Saxony) using conventional alkali extraction and acid precipitation methods. The anticoagulant effect of the test compounds was proven in human citrated plasma using the group assays thrombin time (thrombin-fibrinogen reaction), activated partial thrombo-plastin time (intrinsic system) and prothrombin time (extrinsic system). The thrombin time in fibrinogen solution was also determined. S-Hya-15 and the higher-sulfated CMS-1 exerted the strongest inhibitory effect on coagulation, followed by the low sulfated CMS-2. Compared with the sulfated compounds, humic acids showed a significantly weaker effect in the group assays. The anticoagulant effect of all test compounds was antagonizable with protamine sulfate. Investigations on the cytocompatibility of the test compounds revealed generally low cytotoxicity. After 24-hour exposure of U937 cells to the sulfated test compounds, the half maximum cytotoxic concentration was found to be within the milligram range (>10 mg/ml). After 96-hour exposure, S-Hya-15 and CMS-1 (12.8 mg/ml) revealed a significant antiproliferative effect. The membrane toxicity of the compounds proved to be so low that the half maximum [3H]arachidonic acid release could not be calculated. Therefore, the RC5, i.e. the substance concentration causing 5 % of the maximally possible arachidonic acid release, was used as the criterion for membrane injury. By this means, after 24-hour exposure of the test compounds at 37°C the following ranking for membrane toxicity was found: THS-A1 (RC5 = 1.5 mg/ml) > THS-A2 > S-Hya-15 > CMS-1 = CMS-2 (RC5 > 30.0 mg/ml). Taken together, the carboxymethylated sulfated hyaluronic acids CMS-1 and CMS-2 proved to be highly effective and cytocompatible coagulation inhibitors. Their anticoagulant activity clearly depends on the sulfatation degree (CMS-1 > CMS-2), but does not exceed the effectiveness of sulfated hyaluronic acid.