Biochemische und physiologische Untersuchung der Phytochelatinsynthasen von Arabidopsis thaliana

Abstract

Nicht-essenzielle Schwermetalle wie Cd werden vorwiegend durch die Bildung von kleinen Cystein-reichen Peptiden, den Phytochelatinen (PC), in der Pflanze entgiftet. Die PC werden durch die Phytochelatinsynthasen (PCS) nicht-ribosomal in einer metallabhängigen Reaktion aus Glutathion (GSH) gebildet. Ihre generelle Struktur ist (γ-Glutamyl-Cystein)n-Glycin, wobei eine Anzahl n der γ-Glutamyl-Cystein-Einheit von 2 bis 11 Wiederholungen möglich ist. In verschiedenen Organismen konnte gezeigt werden, dass die PCS essenziell sind für die Detoxifizierung von nicht-essenziellen Schwermetallen wie Cd2+, Hg2+ und dem Metalloid As. Bis heute gibt es aber keinen direkten Nachweis, dass die PCS eine Funktion in der Metallhomöostase essenzieller Metalle haben. Aufgrund sehr viel sensitiveren Methoden konnte der Einfluss der PC-Bildung und der PC-Defizienz auf die Zn2+-Homöostase in Arabidopsis thaliana erneut untersucht werden. So wurde für die bekannte Cd2+-hypersensitive und PC-defiziente cad1-3-Mutante, welche eine Punktmutation im AtPCS1-Gen besitzt, eine erhöhte Zn2+-Sensitivität nachgewiesen. Nach Isolierung einer neuen Mutante, cad1-6, in der das AtPCS1-Gen durch eine T-DNA-Insertion in Exon 8 inaktiviert wurde, konnte die Cd2+- und Zn2+-Hypersensitivität der cad1-3-Mutante bestätigt werden. In Massenspektrometrischen Analysen (capLC-ESI-QTOF-MS) wurde nachgewiesen, dass Zn2+, wie auch Cd2+ als der stärkste Aktivator, die PC-Bildung in Wildtyp-Pflanzen (WT) Ecotyp Columbia induziert. Auch in Abwesenheit von erhöhten Schwermetallen im Pflanzenmedium wurde eine geringe PC-Bildung in WT Pflanzen gemessen. Die Mutanten cad1-3 und cad1-6 zeigten weiterhin eine signifikante reduzierte Cd2+- und Zn2+-Aufnahme in die Wurzeln als WT-Pflanzen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die PC maßgeblich an der Akkumulation und Detoxifikation von Zn2+ beteiligt sind. Diese Funktion erklärt möglicherweise die evolutionäre Konservierung der PCS im Pflanzenreich und anderen Organismen. AtPCS2 ist das zweite funktionale PCS-Gen in Arabidopsis. AtPCS2 ist wie auch AtPCS1 konstitutiv exprimiert, jedoch deutlich schwächer. Eine Funktion von AtPCS2 in Arabidopsis ist bisher nicht bekannt. Durch Überexpression in der bekannten cad1-3-Mutante sollten Funktionen von AtPCS2 identifiziert werden. Ergebnisse zeigten, dass AtPCS2 auch in einer stark erhöhten Expression die Cd2+- und Zn2+-Hypersensitivität der cad1-3-Mutante nicht komplementieren kann. In capLC-ESI-QTOF-MS-Analysen konnte für AtPCS2 eine Aktivität nach Cd2+- und Zn2+-Behandlung in planta nachgewiesen werden. Die nachgewiesene PC-Bildung in transgenen cad1-3-Pflanzen, die AtPCS2 überexprimieren, ist aber nicht ausreichend für eine erhöhte Toleranz gegenüber diesen Schwermetallen. Eine spezifische Funktion für AtPCS2 ist weiterhin unbekannt. Weiterhin ist bekannt dass AtPCS2 in einer heterologen Expression in Hefen nach Cd2+-Behandlung Aktivität zeigt. Nach Cu2+-Behandlung konnte jedoch keine Aktivität nachgewiesen werden. In Sequenzvergleichen konnte gezeigt werden, dass bestimmt Aminosäuren in AtPCS2 verändert sind, die in anderen PCS zu 100 % konserviert sind. Durch Mutation von AtPCS1 und der Expression dieser Mutantenversionen in der Cd2+- und Cu2+-sensitiven Saccharomyces cerevisiae Δcup1-Mutante, wurde eine Aminosäure (Cys113) identifiziert, die für die Cu2+-Aktivierung essenziell ist. Diese Mutation in AtPCS1 kann die erhöhte Cu2+-Sensitivät der Δcup1-Mutante nicht mehr vollständig komplementieren, während die Cd2+-Aktivierung dieser Mutation unbeeinflusst war. Die Ergebnisse unterstützen das Modell einer direkten Metallbindung an bestimmte Sequenzbereiche des PCS-Proteins wodurch die Aktivierung der PC-Synthese erfolgt.

Non essential heavy metals like Cd2+ are mainly detoxified in plants by the synthesis of small Cystein-rich peptides the phytochelatins (PC). PC are synthesized non-ribosomal from Glutathione (GSH) by the enzyme phytochelatin synthase in a metal dependent manner. Their general structure is (gγ-Glutamyl-Cysteine)n-Glycine, where n grows from 2 to 11. PCS are essential for detoxification of non-essential heavy metals like Cd2+, Pb2+ or the metalloid As in different organism. But to date, no direct evidence was reported for a role of PCS in the metal homeostasis of essential heavy metals. We were able to re-investigate the influence of PC synthesis and PC deficiency in Arabidopsis in zinc homeostasis because of more sensitive methods. We found that the kwon Cd2+ hypersensitive and PC deficient cad1-3 mutant, which had a point mutation in the AtPCS1 gene, show a pronounced Zn2+ hypersensitivity, The mutant phenotype of cad1-3 was confirmed in a new isolated mutant, cad1-6, with a T-DNA insertion in AtPCS1. In cap-LC-ESI-QTOF-MS analysis was shown that Zn2+ also like Cd2+ as a strong activator induce the PC synthesis in wild type (WT) plants. PC were also detectable in the absence of heavy metals in the growth medium in WT plants. It was also shown that cad1-3 and cad1-6 have a significant reduction in root Zn2+ accumulation. These results indicate an essential role of PC in the accumulation and detoxification of Zn2+. This function could explain the evolutionary conservation of PCS in the plant kingdom and also other organisms. AtPCS2 is the second functional PCS in Arabidopsis. AtPCS2 is like AtPCS1 constitutively expressed albeit at lower level. To date no function of AtPCS2 in Arabidopsis is known. To identify function of AtPCS2 the gene was over expressed in the known cad1-3-mutant. Results show that AtPCS2 is not able to complement the Cd2+ and Zn2+ hypersensitivity of cad1-3 by over expression. In CapLC-ESI-QTOF-MS analysis activity of AtPCS2 was measured in planta after treatment with Cd2+ and Zn2+. The measured PC accumulation in transgenic cad1-3 plants which over expressed AtPCS2 was not sufficient for an increased tolerance to these heavy metals. A specific function for AtPCS2 is further unknown. Furthermore is known that AtPCS2 shows activity in a heterologous expression in yeast after Cd2+ treatment. After Cu2+ treatment no activity was measurable. In Sequence alignments was shown that determined amino acid are changed in AtPCS2 which are 100 % conserved in other PCS. After mutation of these amino acids in AtPCS1 and expression of the mutant version in the Cd2+ and Cu2+ sensitive Saccharomyces cerevisiae Δcup1 mutant one amino acid, Cystein 113, was identified essential for Cu2+ activity. This mutation in AtPCS1 could not complement the Cu2+ hypersensitivity of Δcup1 while the Cd2+ activation was not influenced. The results support the model of direct metal binding to specific binding sites of the PCS protein to activate PC synthesis.