Protein - protein interaction studies by chemical cross-linking and mass spectrometry

Abstract

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kombination aus chemischem Cross-Linking - eine Methode zur kovalenten Verknüpfung räumlich benachbarter funktioneller Gruppen von Aminosäuren mittels eines chemischen Reagenzes -, hochauflösender Massenspektrometrie und computergestützten Methoden einen leistungsstarken Ansatz für die strukturelle Charakterisierung von Proteinkomplexen darstellt. Diese Strategie wurde für die Strukturaufklärung des 20 kDa-Calmodulin / Melittin-Komplexes eingesetzt und als Weiterentwicklung auf den 100 kDa-Heterotetramer-Komplex zwischen Annexin A2 (ANXA2) und S100A10 (p11) angewendet. Der ANXA2 / p11-Komplex (A2t) wurde aus der Mucosa des Schweinedünndarms (Sus scrofa) isoliert und gereinigt. Darüber hinaus wurde ein Protokoll auf Grundlage von chemischem Cross-Linking und Massenspektrometrie zur Identifizierung spezifischer A2t Bindungspartner entwickelt. Die Kontaktregionen des Ca2+-abhängigen Komplexes zwischen Calmodulin (CaM) und Melittin und damit die Orientierung von Melittin innerhalb des Komplexes wurden bestimmt. Für die Strukturuntersuchung des Annexin A2 / p11-Tetramers (A2t) wurden isotopenmarkierte Cross-Linking-Reagenzien verwendet, was die Identifizierung von Cross-Linking-Produkten entscheidend vereinfachte. Desweiteren erwies sich die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) als außerordentlich wichtig für die präzise Lokalisierung der verknüpften Aminosäuren sowie für die eindeutige Zuordnung von Cross-Linking-Produkten. Die Strukturmodelle des ANXA2 / p11-Komplexes favorisieren die in-vivo Bildung eines Oktamers. Die Zuordnung der Cross-Linking-Produkte ist für relativ kleine Proteinkomplexe, wie dem 20 kDa-Komplex zwischen CaM und Melittin, allein anhand der hochgenauen Massen möglich. Es konnte hingegen gezeigt werden, dass für die korrekte Zuordnung der Cross-Linking-Produkte größerer Proteinkomplexe sowohl der Einsatz isotopenmarkierter Reagenzien, als auch der Tandem-Massenspektrometrie von außerordentlicher Wichtigkeit ist.

In the present work, it was demonstrated that chemical cross-linking - the process of covalent attachment of near-neighbor amino acid functional groups - in combination with high-resolution mass spectrometry and computational methods represents a powerful approach for the structural characterization of protein complexes. The strategy was employed for structural characterization of the 20 kDa calmodulin / melittin complex and the established protocol was advanced to elucidate the quaternary structure of the 100 kDa heterotetramer complex between annexin A2 (ANXA2) and p11 (S100A10). The ANXA2 / p11 complex (A2t) was purified from small intestinal mucosa of the pig (Sus scrofa). Moreover, a protocol for the identification of A2t interaction partners based on chemical cross-linking and mass spectrometric analysis was developed. The interacting regions within the calcium-dependent complex between calmodulin (CaM) and melittin, and thus the orientation of melittin within the complex were determined. The spatial organization of the annexin A2 / p11 heterotetramer was scrutinized employing isotope-labeled cross-linking reagents, which facilitated identification of cross-linked products. Tandem mass spectrometry (MS/MS) proved invaluable for an exact localization of cross-linked amino acid residues and for a confirmation of correct cross-linked product assignment. The obtained structural models favour in-vivo formation an octamer. Cross-linked product assignment merely based on exact mass measurements proved feasible for relatively small protein complexes, such as the 20 kDa-complex between CaM and melittin, whereas for larger protein assemblies both the application of isotope-labeled cross-linking reagents and tandem mass spectrometry were indispensable for an unambiguous assignment of cross-linked products.