Beiträge zu neuartigen antiinflammatorischen Therapieansätzen durch die pharmazeutische Ausnutzung von Selektinen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit soll die pharmazeutische Relevanz der Selektine verdeutlicht werden. Zu diesem Zweck wurden Beiträge zur Aufklärung der molekularen Bindungseigenschaften der Selektine erbracht, auf denen aufbauend verschiedene Verbindungen als Selektininhibitoren untersucht und in ihrer Perspektive als potentielle antiinflammatorische Substanzen dargestellt wurden. Weiterhin wird mit der Nutzung von Selektinen als Targetstruktur für Arzneimittelvehikel ein neuer Weg für die Effektivierung einer antiinflammatorischen Therapie aufgezeigt. Selektine nehmen auf Grund ihrer initialen Stellung in der Adhäsionskaskade der Leukozyten unter Entzündungsbedingungen eine Schlüsselrolle in der Entzündungsentstehung ein. Die von den Selektinen vermittelte Leukozytenbindung äußert sich in einer Zellrollbewegung unter Scherflußbedingungen, so daß neben ihrer physiologischen Funktion die Selektine auch durch diese einmalige Sonderform einer Adhäsion aus mechanistisch/biophysikalischer Sicht sehr interessant erscheinen. In der vorliegenden Arbeit wird ein abstrahierendes Testmodell vorgestellt, mit dem im Prozeß des Selektin-vermittelten Zellrollens auf die funktionellen Aspekte der Selektinliganden fokussiert werden kann. Die natürlichen mucinähnlichen Selektinliganden sind in ihrer Funktion der Rollvermittlung ungenügend charakterisiert. Durch Einsatz einer modifizierbaren ligandhaltigen Modellmembran wurde deutlich, daß die Summation vieler schwachaffiner, aber räumlich konzentrierter Einzelbindungen eine essentielle Bindungsvoraussetzung für die Selektine im Rollprozeß darstellt. Daraus konnte postuliert werden, daß die natürlichen Selektinliganden durch eine Multimerisierung von schwach affinen Kohlenhydratepitopen im Molekül die notwendige Bindungsaffinität zu den Selektinen erlangen. Weiterhin wurde deutlich, daß eine Flexibilitätszunahme der in den Ligandenstrukturen das Rollverhalten forciert und damit die Zahl der notwendigen einzelnen Bindungsepitope reduziert werden kann. Mit dieser funktionsfähigen Zellrollanordnung wurden in weitergehenden Untersuchungen Substanzen auf ihre Selektin-inhibierende Wirksamkeit charakterisiert. Da Selektine an einer Vielzahl von pathologischen Entzündungsereignissen beteiligt sind, könnte aus der Blockierung der Selektine die Möglichkeit einer frühen und kausalen Einflußnahme bzw. Unterdrückung dieser pathologischen Prozesse resultieren. In dem dynamischen Rollassay wurden verschiedene glykosidische Verbindungen getestet, woraus sich Struktur-Wirkungs-Beziehungen für potente Selektininhibitoren ableiteten. Das dynamische Testassay erwies sich dabei als aussagefähiger als die gebräuchlichen statischen Zellbindungs-Untersuchungen. Da die vaskulären Selektine räumlich und zeitlich an das Entzündungsgeschehen gebunden von den Endothelzellen exprimiert werden, wurden sie in dieser Arbeit als Targetstrukturen für Arzneimittelvehikel vorgeschlagen. Mit diesem völlig neuartigen Prinzip sollen Arzneistoffe gezielt zum entzündeten Gewebe transportiert werden können, um somit eine antiinflammatorische Therapie zu effektivieren. Als Arzneistoffvehikel werden in dieser Arbeit sog. Immunoliposomen angewendet. Mit einer neuartigen Methode wurden Selektin-Antikörper an Liposomen gekoppelt und deren Targetierungsverhalten an isolierten humanen Endothelzellen in verschiedenen Modellen untersucht. Aufbauend auf dem erfolgreichen Targeting der Liposomen wurde deren Verhalten an den Zielzellen analysiert, um daraus Konsequenzen für die therapeutische Nutzung zu ziehen. In Hinblick auf zukünftige in vivo-Anwendungen wurde das immunogene Potential dieser Immunoliposomen durch Immunogenitätsuntersuchungen in Ratten bei mehrfacher Applikation bestimmt und auf die strukturellen Eigenschaften der Immunoliposomen zurückgeführt.

These thesis focus on a group of adhesion receptors, the selectins and demonstrate their pharmaceutical relevance in the search for new aspects in an antiinflammatory therapy. Therefore, various in vitro model experiments have been performed to evaluate the molecular binding characteristics of the selectins. Basing on these studies, several selectin inhibitors were tested as potential antiinflammatory compounds. Finally, vascular selectins were suggested to be used as target structures for drug vehicles, such as liposomes to get an antiinflammatory directed drug targeting. The selectins are a family of three carbohydrate binding proteins that were specifically expressed on both leukocyte and endothelial surface under inflammatory conditions. The selectins initiate the leukocyte adhesion at the vascular surface at inflammatory sites by mediating a rolling slow down movement of the leukocytes in the vascular shear force. This initial role in the immune response make selectins attractive targets in an antiinflammatory research. In order to investigate the molecular binding characteristics of the selectins, we established a parallel plate flow chamber in which we could simulate the leukocyte rolling along a ligand containing model membrane under in vitro conditions. By modifying the ligands, essential prerequisites for the molecular recognition of selectins in the cell rolling process could be demonstrated. It could be proved that the high binding affinity of selectins to their ligands might be a result of the multimerisation of several locally clustered low affine binding epitopes. Additionally, the flow chamber apparature was used to search for selectin inhibitors as potential antiinflammatory drugs. A series of glycolipids has been used and the resulting inhibition data were discussed with respect to structure-activity relationsship of potential blocking compounds. Since vascular selectins were strictly expressed at sites of inflammation, they appear as excellent target structures to direct drugs or drug vehicles to the inflamed tissue. We used liposomes as drug delivery system which got their target specifity by coupling selectin antibodies onto the liposomal surface. We analysed the targetability of these "immunoliposomes" under vitro conditions and followed their fate at the endothelial cells after target binding. It became evident that the targeted liposomes were partly be taken up by the cells which might be a basis for liposomal gene therapy. With respect to future in vivo applications, the immunogenicity of these immunoliposomes have been evaluated upon repeated injections in rats.