Topologie des CzcCBA-Efflux-Komplexes aus Ralstonia metallidurans CH34

Abstract

Die Resistenz von Ralstonia metallidurans CH34 gegenüber den Schwermetall-Kationen Co 2+ , Zn 2+ und Cd 2+ wird durch die czc-Determinante vermittelt, die auf dem Megaplasmid pMOL30 liegt. Die Strukturgen-Region der Determinante kodiert für den chemiosmotisch getriebenen CzcCBA-Efflux-Komplex. In dieser Arbeit wird die Lokalisation der Komponenten und die Struktur des Membranprotein-Komplexes näher charakterisiert. Nach Zellfraktionierung befinden sich CzcC und CzcB hauptsächlich in der Membran-Fraktion, nach Trennung der Membranen in äußere und innere Membran im Saccharose-Dichtegradienten werden sie in Fraktionen höherer Dichte angereichert. Um die Lokalisation und Topologie der Komponenten detaillierter studieren zu können, wurden Reporterplasmide für die Konstruktion von Translationsfusionen entwickelt, deren Funktion mit Kontrollfusionen getestet wurde, die für Hybridproteine bekannter Lokalisation kodierten. Große Teile von CzcC sind im Periplasma lokalisiert. Dies belegen die Aktivitäten von CzcC'-'PhoA-Fusionen. Auch CzcB erstreckt sich über den periplasmatischen Raum. Dafür sprechen die Aktivitäten von CzcB'-'PhoA-Hybridproteinen. Für die Membran-Topologie des polytopischen Transporters der inneren Membran CzcA wird ein Modell mit zwölf transmembranen Segmenten und zwei großen periplasmatischen Domänen vorgeschlagen, das auf den Aktivitäten von 25 CzcA'-'PhoA-Fusionen und Computervorhersagen beruht. Nach Blue Native PAGE kann neben den einzelnen Untereinheiten CzcB und CzcA ein für beide Proteine spezifisches Signal bei ca. 550 kDa mit Antikörpern identifiziert werden. Schließlich kann durch In vivo-Crosslinking mit Formaldehyd ein CzcB-Komplex von ca. 220 kDa Größe stabilisiert werden. Der Komplex wurde gereinigt und durch Erhitzen auf 96 °C in seine Bestandteile zerlegt.

Ralstonia metallidurans strain CH34 is resistant to cobalt, zinc and cadmium cations. Resistance is mediated by the czc determinant, which is located on plasmid pMOL30. The structural genes of the determinant encode the proton-driven CzcCBA efflux pump. In this study localization of the components and structure of the membrane protein complex were investigated. After cell fractionation the components CzcC and CzcB were found mainly in the membranes. Both components occurred in fractions of higher density, when the membranes were separated in outer and inner membrane by sucrose density gradient centrifugation. To study localization and topology of the components in detail some reporterplasmids for generation of translational fusions were developed. The function of the system was tested by using control fusions encoding for hybrid proteins of known localization. As shown by activities of CzcC'-'PhoA fusions large parts of the protein are located in the periplasm. As revealed by activities of CzcB'-'PhoA fusions CzcB also spans the periplasmic space. The membrane topology of the polytopical inner membrane transporter CzcA was investigated by measuring the activities of 25 CzcA'-'PhoA fusions. In the resulting topological model also based on computer predictions the protein has twelve transmembrane segments and two large periplasmic domains. Beside the single subunits CzcB and CzcA a weak signal at 550 kDa was identified by blue native electrophoresis followed by westernblot analysis using antibodies against both proteins. Finally, a complex merely composed of CzcB (220 kDa) was stabilized by in vivo crosslinking with formaldehyde. The complex was isolated and cleaved in its components by heating at 96 °C.