Das Gen der Sinapoylglucose - L-Malat-Sinapoyltransferase von Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Ackerschmalwand): Klonierung durch T-DNA-Tagging und Versuche zur Expression in Escherichia coli

Abstract

Ester der Sinapinsäure sind Endprodukte des Phenylpropan-Stoffwechsels in Arabidopsis und einigen anderen Brassicaceen (Kreuzblütler). Bei Arabidopsis wurde gezeigt, dass diese löslichen Sekundärstoffe eine wichtige Rolle spielen als Schutzfilter gegen schädigende UV-Strahlung. Durch ihre sichtbare und typische Fluoreszenz im UV-Licht sind sie in vivo und in vitro relativ leicht zu detektieren, womit sie sich als Indikatoren für eine Mutagenese der Phenylpropan-Biosynthese eignen. Im Arabidopsis-Wildtyp ist 1-O-Sinapoyl-ß-D-glucose die Vorstufe von 2-O-Sinapoyl-L-malat, das vor allem in der oberen Epidermis der Blätter akkumuliert. Die Umwandlung dieser Ester wird von der Sinapoylglucose:L-Malat-O-Sinapoyltransferase (SMT; EC 2.3.1.92) katalysiert, einem in der Vakuole lokalisierten Enzym. Solche, auf dem hohen Gruppenübertragungspotential eines 1-O-ß-Acylglucoseesters beruhende Transacylierungen sind ein wichtiger Bestandteil des Sekundärstoffwechsels höherer Pflanzen. Trotzdem waren die Gene und Proteine der daran beteiligten Acyltransferasen bisher auf molekularer Ebene unbekannt. Die Arabidopsis-Mutante sinapoylglucose accumulator 1 (sng1) enthält keine SMT-Aktivität und akkumuliert Sinapoylglucose anstelle von Sinapoylmalat, was auf einen Defekt im SMT-Gen hinwies. Um dieses zu klonieren, wurde eine T-DNA-getaggte sng1-Mutante identifiziert, woraus mit der inversen Polymerase-Kettenreaktion die Isolation von genomischer DNA flankierend zum Insertionselement gelang. Diese war ein Teil des Arabidopsis-Gens Nr. At2g22990 (GenBank-Nr. AF275313), das nach Agrobacterium tumefaciens-Transformation die sng1-Mutante komplementierte. Das SNG1-Gen befindet sich im Abschnitt 131 des Arabidopsis-Chromosoms 2 (GenBank-Nr. AC00-4401), was einer Position bei 38,06 cM (Marker pCC300) auf der Karte rekombinanter Inzuchtlinien von Lister und Dean entspricht. Das kodierte Protein (GenBank-Nr. AAF78760) besteht aus 433 Aminosäuren, hat eine molare Masse von ~ 50 kDa und besaß SMT-Aktivität bei Expression in Escherichia coli. Die Sequenz weist große ähnlichkeit auf zu Serincarboxypeptidasen (EC 3.4.16, Peptidasen-Familie S10), was sich insbesondere im Vorhandensein einer potenziellen katalytischen Triade (Ser-173, His-411 u. Asp-338) zeigt. Die Aktivität der natürlichen SMT von Arabidopsis wurde durch Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) partiell gehemmt. Die SMT hat sich folglich aus einer Serincarboxypeptidase entwickelt, wobei dem Acyltransfer eventuell ein analoger Mechanismus zugrunde liegt wie der Serin-katalysierten Peptidhydrolyse. Dasselbe wurde zeitgleich zur SMT bei einer Acylglucose-abhängigen Transferase aus Lycopersicon pennellii (Wildtomate; GenBank-Nr. AAF64227) festgestellt und trifft möglicherweise auf weitere Enzyme dieses Typs ebenso zu. Dafür spricht, dass in Arabidopsis durch das Genomprojekt zahlreiche exprimierte Gene identifiziert worden sind, die Proteine mit derzeit unbekannter Funktion aus der Serincarboxypeptidasen-Familie kodieren. ähnliches könnte auch in anderen höheren Pflanzen der Fall sein.

Sinapic acid esters are final products of the phenylpropanoid pathway in Arabidopis and some other members of the Brassicaceae (crucifers). These soluble secondary metabolites have been shown in Arabidopsis to play an important role as protectants against damaging UV light. By their visible and typical fluorescence under UV light, they are relatively easy to detect both in vivo and in vitro, for which reason they are suitable as indicators for the mutagenesis of the phenylpropanoid biosynthesis. In the Arabidopsis wild-type, 1-O-sinapoyl-ß-D-glucose is the precursor of 2-O-sinapoyl-L-malate, which accumulates especially in the upper leave epidermis. The interconversion of these esters is catalyzed by the sinapoylglucose:L-malate O-sinapoyltransferase (SMT, EC 2.3.1.92), an enzyme that is located in the vacuole. Such transacylations, which are based on the high group transfer potential of an 1-O-ß-acylglucoseester, are an important component of the secondary metabolism in higher plants. Nevertheless, the genes and proteins of the involved acyltransferases were so far unknown on the molecular level. The Arabidopsis mutant sinapoylglucose accumulator 1 (sng1) contains no SMT activity and accumulates sinapoylglucose instead of sinapoylmalate, indicating a defect in the SMT gene. To clone it, a T-DNA tagged sng1 mutant was identified, and the inverse polymerase chain reaction was used to isolate genomic DNA adjacent to the insertion element. The obtained DNA was part of the Arabidopsis gene No. At2g22990 (GenBank No. AF275313), which complemented the sng1 mutant after Agrobacterium tumefaciens transformation. The SNG1 gene is located in the section 131 of the Arabidopsis chromosome 2 (GenBank No. AC004401), what corresponds to a position at 38,06 cM (marker pCC300) on the Lister and Dean recombinant inbred lines map. The encoded protein (Gen-Bank No. AAF78760) consists of 433 amino acids, has a molecular mass of ~ 50 kDa and possesses SMT activity when expressed in Escherichia coli. The sequence exhibits high similarity to serine carboxypeptidases (EC 3.4.16, family of peptidases S10), what is shown in particular by the presence of a potential catalytic triade (Ser-173, His-411 and Asp-358). The activity of the natural SMT from Arabidopsis was inhibited partially by phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Thus, the SMT has developed from a serine carboxypeptidase. Accordingly, the acyltransfer by this enzyme is perhaps based on a mechanism analogous to the serine-catalyzed peptide hydrolysis. Simultaneously with the SMT, the same was found for an acylglucose-dependent transferase from Lycopersicon pennellii (wild tomato; GenBank No. AAF64227) and may apply also to other enzymes of that type. In favor of that argues, that numerous expressed genes have been identified in Arabidopsis by the genome project, which encode proteins with at present unknown functions belonging to the family of serine carboxypeptidases. Similar is possibly the case in other higher plants as well.