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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/2976
Title: Protein C von Eubacterium acidaminophilum - Sequenzanalyse und Funktion der Thiole von GrdD für die Freisetzung von Acetylphosphat
Author(s): Kohlstock, Ulf-Martin
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2001
Extent: Online Ressource, Text + Image
Type: Hochschulschrift
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Niedersächsische Staats- und Universitätsbibliothek
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000002501
Subjects: Elektronische Publikation
Zsfassung in engl. Sprache
Abstract: Eubacterium acidaminophilum ist in der Lage, aus der Reduktion von Glycin, Betain und Sarkosin Energie durch die Freisetzung von Acetylphosphat zu konservieren. Dieser Schritt wird durch das Protein C der Glycin-, Sarkosin- und Betain-Reduktase katalysiert. Dabei wird zuerst der Selenoprotein A gebundenen Carboxymethylselenoether reduktiv gespalten und anschließend unter Bildung eines Acetylthioesters an Protein C Acetylphosphat freigesetzt. Die Position der Thiol-Gruppen beider Untereinheiten GrdC und GrdD von Protein C, an der die Acetylthioesterbildung an Protein C erfolgen konnte, war unklar. Nach der vollständigen Klonierung von grdD1 aus E. acidaminophilum wurden zwei Cysteine an den Positionen 98 und 359 ermittelt. Der Sequenzvergleich der Genprodukte von grdC1 und grdC2 (54 kDa-Untereinheit) und grdD (40-kDa-Untereinheit) von E. acidaminophilum mit den homologen Sequenzen anderer Glycin reduzierender Organismen ergab zwei konservierte Cysteine an Positionen 223 und 261 in GrdC und ein konserviertes an Position 359 in GrdD (Sequenz von E. acidaminophilum). Eine Homologie von Cystein 261 in GrdC zum katalytischen Cysteins der β-Ketoacyl-Carrier-Proteinsynthase III, ergab einen Hinweis auf eine Acetylthioesterbildung an GrdC und einer sich anschließenden Transacetylierung auf GrdD während der Katalyse. GrdD als rekombinantes N-terminale Strep-tag-Fusionsprotein war gemessen an der arsenatabhängigen Hydrolyse von Acetylphosphat enzymatisch aktiv, dagegen konnte für GrdC als C-terminales Strep-tag-Fusionsprotein diese Enzymaktivität nicht nachgewiesen werden. Von den zwei exprimierten Mutanten GrdDC98→S und GrdDC359→A besaß GrdDC98→S ebenso wie GrdD Enzymaktivität, dagegen war die GrdDC359→A enzymatisch inaktiv. Eine Carboxymethylierung von Cystein 359 in GrdD konnte nach Inaktivierung des Proteins durch Peptid-Mapping und Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Nach Substratschutz durch Acetylphosphat vor der Inaktivierung durch Jodacetat lag Cystein 359 unmodifiziert vor und ließ sich erst dann mit 4-Vinylpyrdin markieren. Cystein 98 war im nativen Zustand unzugänglich für eine Modifikation und ließ sich erst nach Denaturierung des Proteins carboxymethylieren bzw. pyridylethylieren. So konnte Cystein 359 als katalytisch essentieller Aminosäure-Rest identifiziert und das Ergebnis der Mutagenese bestätigt werden. Durch Atomabsorptionsspektroskopie wurde in heterolog exprimierten GrdC Zink nachgewiesen. Eine Funktion als möglicher Cofaktor beim Transfer der Carboxymethyl-Gruppe von Selenoprotein A über GrdC nach GrdD wurde diskutiert.
Eubacterium acidaminophilum is able to conserve energy from reduction of glycine, betaine and sarcosine by synthesis of acetyl phosphate. This synthesis of acetyl phosphate is catalyzed by protein C of the reductase-complex. Release of acetyl phosphate by protein C takes place after reductive cleavage of carboxymethylselenoether bounded to selenoprotein A and formation of acetyl thioester at protein C. Number and position of reactive and sequenced thiols in the subunits GrdC and GrdD of protein C were still unclear. To investigate this, gene grdD1 of small subunit GrdD was cloned. 2 cysteine residues were analyzed at positions 98 and 359 in GrdD. Comparing gene products of grdC1, grdC2 and grdD1 with their homologues sequences in other glycine reducing organisms, GrdC has two conserved cysteines at positions 223 and 261 and GrdD one conserved cysteine at position 359. The homology of cysteine 261 in GrdC to catalytic cystein of beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III was a first indication for an acetyl thioester formation at subunit GrdC followed by transacetylation to subunit GrdD. Analyzing enzyme activity by arsenate dependent hydrolysis of acetyl phosphate, GrdD as recombinant N-terminal Strep-tag-fusion showed enzyme activity, by contrast to C-terminal Strep-tag fusion of GrdC, that was completely inactive. Mutants GrdDC98→S and GrdDC359→A were expressed and analyzed in comparison to recombinant GrdD. Measuring enzyme activity by catalysis of arsenate-dependent hydrolysis of acetyl phosphate, GrdDC359→S was completely inactive, in contrast to GrdDC98→S, that was still active. After inactivation of GrdD by treatment with iodoacetate in presence or absence of substrate acetyl phosphate, thiols showed different modifications as was proved by peptide mapping and mass spectrometry, cystein 359 was carboxymethylated. After treatment of GrdD with substrate acetyl phosphate before iodo acetate GrdD was still full active. Cysteine 359 was unmodified, therefore it could be labeled by 4 vinyl-pyridine. Cysteine 98 was not accessible to carboxymethylation by iodo acetate in the native enzyme in the presence or absence of the substrate, but could be alkylated after denaturation. This clearly confirmed the catalytic role of cysteine 359 as the active site thiol of GrdD responsible for release of acetyl phosphate. By atom absorption spectrometry zinc, was found in the recombinant subunit GrdC. The possible function of zinc as cofactor of GrdC in catalyzing a transfer of carboxymethyl group from selenoprotein A to GrdD was discussed.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/9761
http://dx.doi.org/10.25673/2976
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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