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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/2999
Title: Der Einfluß von oxidativem Stress auf die antioxidativen Enzyme von Lungenzellen und Aspekte zum Mechanismus der Paraquattoxizität
Author(s): Weidauer, Enrico
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2001
Extent: Online Ressource, Text + Image
Type: Hochschulschrift
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Niedersächsische Staats- und Universitätsbibliothek
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000002788
Subjects: Elektronische Publikation
Zsfassung in engl. Sprache
Abstract: Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und freie Radikale spielen eine wichtige Rolle in lebenden Systemen. Es ist bekannt, dass verschiedene Zelltypen auf oxidativen Stress mit einer Erhöhung ihrer antioxidativen Enzymkapazität reagieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob verschiedene Lungenzelltypen in der Lage sind ihre Enzymkapazität anzupassen. Zur Generierung von ROS wurde das Herbizid Paraquat (PQ) und Wasserstoffperoxid (H2O2), eingesetzt. Als Untersuchungsobjekt dienten humane Bronchialepithelzellen (NHBEZ), primäre AII-Zellen (Ratte) und zwei humane Tumorzelllinien. Die Untersuchung der mRNA-Expression erfolgte mit Northern-Blot-Analytik und RT-PCR-Technik. Es wurden die Grundexpressionsmuster für Katalase, Mangan-Superoxiddismutase und Kupfer/Zink-Superoxiddismutase im Kulturverlauf bestimmt. Die absoluten Enzymaktivitäten der Tumorlinien und der Lunge wurden mittels Enzymassays bestimmt. Nach einer Inkubation der Kulturen mit PQ oder H2O2 erfolgte die Bestimmung der konzentrationsabhängigen Toxizitätsdaten mit einem Vitalitätstest (MTT) und die Bestimmung von Malondialdehyd (MDA), einem Abbauprodukt der Lipidperoxidation im Kulturmedium. Nach einer Inkubation mit PQ oder H2O2 fand sich in keinem der untersuchten Zellsysteme eine signifikante Erhöhung der Expressionsraten der mRNA für die untersuchten Enzyme. Durch verschiedene Enzymsysteme kann Paraquat in Form von PQ2 zum Paraquatradikal (PQ⋅+) überführt werden. Der Hauptschädigungsmechanismus von PQ wird über die Generierung von Superoxidanionen (O⋅-, Einelektronübertragung von PQ⋅+ auf O2) angenommen. Um den Mechanismus der Paraquattoxizität zu untersuchen, wurden einige Aspekte der PQ-Radikal-Generierung näher betrachtet. Dazu wurde in einem Mikrosomensystem (Ratte) die Generierung von Superoxidanionen (Lucigenin und Nitro-Blue-Tetrazolium als Detektormoleküle) und der Sauerstoff- und NADPH-Verbrauch durch den Zusatz von PQ untersucht. PQ steigerte den Sauerstoff- und NADPH-Verbrauch, aber nicht die Generierung von Superoxidanionen. Wegen des schweren klinisch/pathologischen Bildes nach einer Paraquatvergiftung wird eine Mitbeteiligung von Hydroxylradikalen diskutiert. Es wird davon ausgegangen, dass Übergangsmetallionen für die Generierung von Hydroxylradikalen, im Sinne einer Fenton-Reaktion, erforderlich sind. Das reduzierte PQ⋅+ lässt sich unter anaeroben Bedingungen stabilisieren. Mit dem chemischen Reduktionsmittel Natriumdithionit (NDT) und einem enzymatischen System, bestehend aus Xanthin und Xanthinoxidase (XO/X), wurden zwei Reduktionssysteme unter anaeroben Bedingungen etabliert. Die Generierung von PQ-Radikalen wurde mittels UV-VIS- und ESR-Spektroskopie untersucht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass unter bestimmten Bedingungen, in Abwesenheit von freien Metallionen, PQ⋅+ aus H2O2 Hydroxylradikale generieren kann. PQ⋅+ akzeptiert molekularen Sauerstoff besser als H2O2 als Elektronenakzeptor. Über eine Verschiebung des intrazellulären Milieus, z.B. durch den erhöhten Sauerstoffverbrauch nach einer PQ-Vergiftung, kann es zu einer quantitativen Umverteilung der Reaktionswege kommen.
Reactive oxygen species, have been implicated in pathogenesis of many lung diseases. Reaktive oxygen species generated by the herbicide paraquat (PQ) are highly toxic for mammals, with the lung being the main target organ. PQ causes lung injury by inducing oxidative stress though redoxcycling. Especially alveolar type II pneumocytes (AII cells) are vulnerable because of active accumulation of PQ. Promotors of reactive oxygen species increase the expression of antioxidant enzymes e.g. catalase and superoxide dismutase in primary cultures of rat hepatocytes and other cell cultures systems. In our work we examined the effect of PQ and hydrogen peroxide (H2O2) on the level of antioxidative enzyme in lung cells. We used human lung tumor cell lines H322 (Clara-cell-like), H358 (AII-cell-like), primary rat AII-cells and normal human bronchial epithelial cells. Cultures were treated for 20 h with either PQ or H2O2. After treatment the viability of the cells remained between 75% and 100% as determined by formazan production capacity (MTT assay). As a marker for oxidative damage lipid peroxidation was monitored by malondialdehyde concentration in the culture media. H2O2 treatment increased malondialdehyd levels in all cell systems, whereas PQ increasd malondialdehyd levels only in AII-cultures. The enzymatic activity of antioxidative enzymes in lung cells and tissue (rat), are much lower than that in liver tissue (rat). PQ or H2O2 treatment had no effect on antioxidative enzyme activity in H322 and H358 cell cultures. The mRNA expression of catalase, Mn and Cu/Zn superoxid dismutase was detected by Northern Blot analysis and by RT-PCR. PQ and H2O2 did not alter basal mRNA levels of antioxidative enzymes in all cell systems. For a better understanding of the mechanism underlying the toxicity of paraquat we investigated some aspects of PQ-radical formation in a rat liver and lung microsomal system. We measured the rate of NAD(P)H and oxygen consumption by microsomal membranes in the presence or absence of PQ. Furthermore the formation of superoxide radicals (⋅O2-) from molecular oxygen by the interaction of PQ-radical with oxygen was monitored using the ⋅O2- triggerred lucigenin-chemoluminescence or alternatively, the reduction of nitro blue tetrazolium (NBT) to the coloured formazan by O2. Under anaerobic conditions the PQ-radical is a stabile compound, characterized by its deep blue colour. This paramagnetic PQ-radical can be formed either by reduction of PQ using sodiumdithionite or by reduction of PQ mediated by the xantin oxidase/xantin reaction in the absence of oxygen. The presence of the PQ-radical was demonstrated under anaerobic conditions by ESR-spectroscopy. After addition of hydrogen peroxide the PQ-radical is transformed to the diamagnetic PQ-dication. Using the spin trap DEPMPO, which is able to form adducts with the very aggressive hydroxyl radical (⋅OH) we were able to show, that during interaction between the PQ-radical and H2O2 a certain amount of ⋅OH must be formed, since DEPMPO-⋅OH-adducts could be clearly identified by electron-spin-resonance spectroscopy. Further efforts are necessary to complete our understanding concerning the mechanism of PQ-toxicity.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/9784
http://dx.doi.org/10.25673/2999
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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