Untersuchungen zum zytotoxischen und zytoprotektiven Potential ausgewählter Radikalfänger an humanen Keratinozyten

Abstract

Die Haut als größtes Organ des menschlichen Körpers und Hauptbarriere zum umgebenden Milieu ist permanent unterschiedlichen schädigenden Faktoren, z.B. dem UV-Licht, ausgesetzt. Es ist bekannt, daß UV-Strahlung an der Generierung freier Radikale und reaktiver Sauerstoffspezies im epidermalen Gewebe beteiligt ist. Einen Schutz vor Zellschäden könnte durch eine topische Anwendung von Radikalfängern erreicht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Substanzen (Melatonin, N-Acetylserotonin, Quercetin, Kämpferol, Rutin) mit beschriebenen antioxidativen Eigenschaften hinsichtlich ihrer zytotoxischen und zytoprotektiven Eigenschaften an humanen Keratinozyten untersucht. Niedrige Konzentrationen an Quercetin (5, 10 und 15 µM) und Kämpferol (3, 6 und 12 µM) führten zu einer dosisabhängigen Abnahme der Proliferationsrate und der Lebendzellanzahl bereits nach 24 h während Rutin, Melatonin und die Modellsubstanz N-Acetylserotonin vom in vitro Zellsystem gut toleriert wurden. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß eine Vorinkubation (2 h) mit Rutin (50, 100 und 200 µM), Melatonin (0,1 und 1 mM) oder N-Acetylserotonin (1 mM) und eine Inkubation während der UV-B Bestrahlung (100 mJ/cm²) zu einer Zytoprotektion führte, die zum Teil mit der UV-Absorption im UV-B Wellenlängenbereich zusammenhängt. Im Gegensatz dazu verursachte die gleichzeitige Inkubation mit der höchsten Melatoninkonzentration von 1 mM während der UV-A Bestrahlung (15 J/cm²) eine zusätzliche Abnahme der Proliferationsrate und der Lebendzellanzahl im Vergleich zur bestrahlten Kontrolle. Außerdem konnte eine Apoptoseinduktion flowzytometrisch mit Hilfe des APO2.7 und des Annexin-V/PI Tests detektiert werden. Daneben wurde ein starker Anstieg intrazellulärer Peroxide (DHR Test) nach Melatoninsupplementierung und UV-A Bestrahlung gemessen. Andererseits zeigte eine gleichzeitige Anwendung von Rutin während der UV-A Bestrahlung photoprotektive Effekte. Weiterhin wurde eine UV-A und UV-B induzierte Generierung intrazellulärer Peroxide durch eine Vorbehandlung mit Rutin vermindert. Abschließend kann gesagt werden, daß eine topische Anwendung von Rutin sinnvoll erscheint, während ein externer Einsatz von Melatonin aufgrund der Photoinstabilität und Phototoxizität an humanen Keratinozyten fragwürdig ist.

The skin as largest organ of the human body and main barrier to the environment is permanently exposed to different damaging factors, especially ultraviolet light. It is well-known that UV radiation is involved in the generation of free radicals and reactive oxygen species in epidermal tissue. A protection against cell damages could be achieved due to a topical application of free radical scavengers. In the present study, various substances (melatonin, N-acetylserotonin, quercetin, kaempferol, rutin) with described antioxidant capacities were investigated mainly regarding to their cytotoxic and cytoprotective properties on human keratinocytes. Low concentrations of quercetin (5, 10 and 15 µM) and kaempferol (3, 6 and 12 µM) led to a dose dependent decrease of the proliferation rate and the living cell number already after 24 h whereas rutin, melatonin and the model substance N-acetylserotonin were well tolerated in the in vitro cell system. Furthermore it could be shown that a preincubation (2 h) with rutin (50, 100 and 200 µM), melatonin (0,1 and 1 mM) or N-acetylserotonin (1 mM) respectively together with an incubation during the UV-B irradiation (100 mJ/cm²) led to a cytoprotection which is partly associated with the UV-B absorption abilities. By way of contrast, a simultaneous incubation with the highest melatonin concentration of 1 mM during the UV-A irradiation (15 J/cm²) caused an additional decrease of the proliferation rate and the living cell number compared to the irradiated control. In addition to this finding an induction of apoptosis could be detected with the APO2.7-test and the Annexin-V/PI test using flow cytometry. Moreover, a strong increase of intracellular peroxides (DHR test) was measured after melatonin supplementation and UV-A irradiation. On the other hand, a supplementation with rutin during the UV-A irradiation showed photoprotective effects. Furthermore, a UV-A and UV-B induced generation of intracellular peroxides was reduced due to a pretreatment with rutin. Finally it can be concluded, that a topical application of rutin seems to be useful, while an external use of melatonin appears questionable because of the photoinstability and phototoxicity on human keratinocytes.