Proteinchemische und molekularbiologische Charakterisierung der D-Prolin-Reduktase aus Clostridium sticklandii

Abstract

Die D-Prolin-Reduktase katalysiert die reduktive Ringspaltung des D-Prolins zu δ-Aminovalerat im Zuge der Stickland-Reaktion. Das Enzym wurde aus dem strikt anaeroben Bakterium Clostridium sticklandii nach einem modifizierten Reinigungsschema zur Homogenität gereinigt. Das im Cytoplasma lokalisierte Enzym besitzt eine heterodekamere Struktur und eine native molekulare Masse von ca. 870 kDa. Das Protein besteht aus drei Untereinheiten entsprechend molekularen Massen von 23, 26 und 45 kDa. Die 23 kDa Untereinheit ist N-terminal durch eine Pyruvylgruppe blockiert und konnte erst nach Reaktion mit o-Phenylendiamin der Sequenzierung mittels Edman-Abbau zugeführt werden. L-[14C]-Prolin bindet unter Zugabe der Prolin-Racemase und NaBH4 kovalent an die 23 kDa Untereinheit. Die 26 kDa Untereinheit enthält Selen in Form von Selenocystein, was mit dem Nachweis von 1,06 g-Atom Selen pro Protomer mittels ICPMS korreliert. Die gereinigte D-Prolin-Reduktase enthält vermutlich keine weiteren Cofaktoren Es konnte ein 4,8 kb großes EcoRI-Fragment isoliert und sequenziert werden, welches die Gene prdA und prdB enthält. Das Gen prdA kodiert für ein 68 kDa großes Proprotein, welches unter Ausbildung einer Pyruvylgruppe posttranslational in die 23 kDa Untereinheit und in die 45 kDa Untereinheit gespalten wird. Das Gen prdB kodiert für die 26 kDa Untereinheit und enthält ein "in frame" UGA-Triplett, welches für Selenocystein kodiert. Die Gene prdA und prdB werden gemeinsam auf einer 4,5 kb großen mRNA transkribiert. Eine weitere 0,8 kb große mRNA fungiert als ein zusätzliches Transkript für die 26 kDa Untereinheit.

D-proline reductase is involved in amino acid metabolism of several clostridia and catalyzes the reductive ring cleavage of D-proline to δ-aminovalerate in a typical Stickland reaction. The enzyme was obtained from the strictly anaerobic bacterium Clostridium sticklandii by a modified purification scheme. The cytoplasmic enzyme had a molecular mass of about 870-kDa and was composed of three subunits with molecular masses of 23, 26 and 45 kDa. The 23-kDa subunit was blocked at its N-terminus by a pyruvoyl group, which could labeled with fluorescein thiosemicarbazide and removed by o-phenylenediamine. L-[14C]-proline was covalently bound to the 23-kDa subunit if proline racemase and NaBH4 were added. In the 26-kDa subunit selenocysteine was detected, which correlated with an identified selenium content of 1.06 g-atom per protomer by ICPMS. Absorption spectra of purified D-proline reductase showed no characteristics that might indicate bound other cofactors. A 4,8 kb EcoRI fragment was isolated and sequenced containing the two genes prdA and prdB. The gene prdA coding for a 68-kDa proprotein, which was posttranslationally cleaved to give the 45 kDa subunit and the pyruvoyl-containing 23-kDa subunit. The gene prdB encoded the 26-kDa subunit and contained an in frame UGA codon for selenocysteine insertion. prdA and prdB were transcribed together on a 4.5-kb mRNA. An additionally 0.8-kb mRNA was identified, which was an extra transcript for prdB.