Konformerspezifität der Proteinphosphatase 2A bei der Dephosphorylierung prolinspezifischer Phosphorylierungsstellen

Abstract

Die Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Serin- und Threoninresten N-terminal von Prolin (Ser/Thr-Pro Motiven) stellt einen zentralen Mechanismus bei der Regulation zellulärer Abläufe dar. Die prolinspezifischen Proteinkinasen sind Schlüsselenzyme bei der Kontrolle des Zellzyklus und bei der Aktivierung spezifischer Transkriptionsfaktoren nach Stress- oder Wachstumssignalen. Die Besonderheiten der Peptidyl-Prolyl Bindung fördern das gleichzeitige Auftreten von cis und trans Konformer in Peptiden und Proteinen. Die Phosphorylierung von Substraten durch prolingerichtete Proteinkinasen führt zu einzigartigen strukturellen Merkmalen, die an Phosphorylierungsstellen ohne Prolin nicht beobachtet werden. Von einigen biochemischen Prozessen ist bekannt, dass cis/trans Konformere prolinhaltiger Verbindungen unterschiedlich reagieren oder unterschiedliche biologische Aktivität besitzen. Außerdem existieren Enzyme, die Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen (PPIasen), die die cis/trans Isomerisierung der Peptidyl-Prolyl Bindung katalysieren. Einige dieser PPIasen sind spezifisch für phosphorylierte Ser/Thr-Pro Motive (pSer/pThr-Pro). Im Verlauf der Arbeit wurde eine gegenüber pSer/pThr-Pro Motiven hochaktive Proteinphosphatase 2A aus Schweinehirn isoliert und charakterisiert. Mit einer Serie von Peptiden der Sequenz Ala-Ala-Thr(PO3H2)-Xaa-Phe-Gly-NH2 (Xaa = alle proteinogenen Aminosäuren außer Cystein) erfolgte die erste systematische Untersuchung des Einflusses der C-terminal zur Phosphorylierungsstelle gelegenen Aminosäure auf die Dephosphorylierung von Substraten durch die PP2A. Unter Verwendung von Pentapeptidsubstraten konnte erstmals die nahezu absolute Spezifität der PP2A für das trans Konformer des pThr-Pro Motives gezeigt werden. Für eine effektive Dephosphorylierung von Substraten, die in cis Konformation vorliegen, ist die Katalyse der cis/trans Isomerisierung durch pSer/pThr-Pro-spezifische PPIasen (Pin1) Voraussetzung. Anhand der Ergebnisse konnte ein neues Regulationsprinzip für Proteine mit prolinspezifischen Phosphorylierungsstellen postuliert werden.

Phosphorylation and dephosphorylation of serine and threonine residues preceding proline (Ser/Thr-Pro motifs) is a major mechanism for the control of cellular processes. The proline-directed protein kinases are key mediators during cell cycle regulation and stress response. The peptidyl-prolyl bond exists in two distinct but slowly interconverting cis and trans conformations. Substrate phosphorylation by prolin-directed protein kinases leads to an unique structural feature of reaction products that cannot be achieved at phosphorylation sites lacking proline. The cis and trans conformers react divers in some biological processes or contain different biological activity. However, the cis /trans isomerization is catalyzed by peptidyl-prolyl cis/trans isomerases (PPIases). Some of them specifically recognize phosphorylated Ser/Thr-Pro motifs (pSer/pThr-Pro). During this dissertation, a heterotrimeric form of protein phosphatase 2A with high activity towards pSer/pThr-Pro motifs was purified from pig brain and completely characterized. Using a library of peptides with the sequence Ala-Ala-pThr-Xaa-Phe-Gly-NH2 (Xaa = all proteinogenic amino acids except cysteine) the influence of the amino acid following the phosphorylated position on dephosphorylation by PP2A was examined. Using pentapeptide substrates it was shown for the first time that PP2A only dephosphorylates the trans conformer of the pThr-Pro motif. The efficient dephosphorylation of substrates, which are in the cis conformation, requires catalysis of cis/trans isomerization by specific PPIases (Pin1). These results suggest a novel principle for the regulation of proteins containing phosphorylation sites for proline-directed protein kinases.