Strategien zur Herstellung von rekombinantem humanem Proinsulin

Abstract

Im Rahmen der Doktorarbeit wurden Möglichkeiten zur Gewinnung von humanem Proinsulin in seiner nativen Form im Periplasma von E. coli, sowie neue Strategien zur in vitro Faltung von Proinsulin untersucht. Die Herstellung von nativem Proinsulin in E. coli wurde durch verschiedene Strategien optimiert (als Fusionsprotein mit DsbA, durch Kosekretion von Chaperonen, durch Variation der Kultivierungsbedingungen und Einsatz thiolhaltiger Substanzen im Medium). Natives Proinsulin wurde mittels eines Konformations-spezifischen ELISAs nachgewiesen und es wurden Ausbeuten von ca. 1 - 9 mg/g Trockenzellmasse erreicht. Neben der Herstellung von Proinsulin in nativer Form in E. coli wurde die in vitro Faltung von denaturiertem, reduziertem Proinsulin untersucht und mittels reversed phase HPLC analysiert. Unter optimalen Bedingungen wurden Ausbeuten an nativem Proinsulin von 60 - 70 % bzw. 6 mg/ml erreicht. Durch die Faltung von Proinsulin in Gegenwart von Proteindisulfidisomerase (PDI) konnten Aggregation und Disulfidverbrückung als Limitationen der Proinsulinfaltung identifiziert werden. Diese Limitationen wurden durch die Isomerase- und Chaperonfunktion der PDI beeinflußt was in einer beschleunigten Faltung und erhöhten Ausbeute deutlich wurde. Proinsulin ist damit das erste Modellprotein, dessen Faltung durch beide PDI-Funktionen beeinflußt wird.

In this Ph.D. thesis, possibilities to produce human proinsulin in its native conformation in the periplasm of E. coli as well as strategies for in vitro folding of proinsulin were analyzed. Production of native proinsulin in E. coli was optimized by means of different strategies (as fusion protein with DsbA, cosecretion of chaperones, variation of cultivation conditions and addition of thiol containing substances to the medium). Native proinsulin was detected using a conformation specific ELISA and a yield of 1 - 9 mg/g dry cell weight could be obtained. Besides the production of proinsulin in the native conformation in E. coli, in vitro refolding of denatured, reduced proinsulin was investigated and analyzed by reversed phase HPLC. At optimized conditions a yield of 60 - 70 % or 6 mg/ml of native proinsulin was obtained. Aggregation and disulfide bond formation are limitations during proinsulin folding as identified by folding of proinsulin in the presence of protein-disulfide isomerase (PDI). Both, aggregation and disulfide bond formation, are influenced by the isomerase and chaperone function of PDI resulting in a faster folding and higher refolding yield. Therefore, proinsulin is the first model protein shown that PDI influences its folding by both functions.